劉 琨，張 云，趙保才，胡 慧，黃 磊，岳耀輝，馬超鋒，張龍現(xiàn)

(1．信陽市動物疾病預(yù)防控制中心，河南信陽464000;2．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002;3．河南省出入境檢驗檢疫局，河南 鄭 州450002)

豬流感(Swine influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，其臨床特點為突發(fā)高熱，流鼻涕，呼吸困難，咳嗽和體重下降［1］．該病除直接影響豬的自身抵抗力和生產(chǎn)性能外，還會引起妊娠母豬的流產(chǎn)和死產(chǎn)．同時豬流感還會繼發(fā)其他病毒和細菌感染，造成更加嚴(yán)重的經(jīng)濟損失［2，3］．另外，自然條件下經(jīng)常發(fā)生禽和人流感病毒傳播給豬的事件，而SIV也可反傳給禽和人，因此具有重大的公共衛(wèi)生意義［4，5］．有關(guān)豬流感病毒的研究已有較多報道［6～13］．河南是中國養(yǎng)豬大省，為了解河南省豬流感的流行概況，本研究在2009—2010年對河南省多個地區(qū)展開了豬流感流行病學(xué)調(diào)查，并對所獲得的分離株進行了亞型鑒定及生物學(xué)特性研究，以期為河南省乃至華北地區(qū)豬流感的防治提供依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣品采集 采自河南新鄉(xiāng)、漯河、信陽、商丘等地區(qū)的疑似因豬流感死亡豬肺臟樣品63份．1．1．2 血清、細胞和試驗動物 抗雞新城疫(ND)陽性血清和犬腎傳代細胞(MDCK)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實驗室保存;非免疫雞胚購自新鄉(xiāng)原陽某孵化場;SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司．

1．1．3 主要儀器及試劑 智能孵化箱(山東翔宇孵化設(shè)備廠);DYY－Ⅲ超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);超速冷凍離心機(Thermo公司);PTC－200型PCR儀(美國MJ Reasearch公司);Trizol LS Reagent(Invitrogen);M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Premix EX Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa寶生物工程有限公司);小量膠回收試劑盒(Omega公司);1%紅細胞懸液;DMEM培養(yǎng)基;雙抗溶液:注射用青霉素鈉10 000 IU·mL－1(華北制藥集團)，注射用硫酸鏈霉素10 000 IU·mL－1(華北制藥集團)．

1．2 方法

1．2．1 SIV的分離與初步鑒定

1．2．1．1 病料處理 采集病死豬的肺臟組織在無菌條件下剪碎并研磨，用PBS液(含鏈霉素和青霉素終濃度為3 000 IU·mL－1)制成10%的勻漿，4℃作用5 h，反復(fù)凍融3次，4℃ 5 000 r·min－1離心4 min，取上清液備用．

1．2．1．2 雞胚接種 將經(jīng)上述方法處理的上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡非免疫雞胚，每枚0．2 mL，每個樣品接種2枚，35℃條件下孵育96 h．每隔8 h照胚，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收集24～96 h死亡和未死亡雞胚置4℃過夜，次日無菌收集尿囊液．

1．2．1．3 紅細胞凝集(HA)和血凝集抑制(HI)試驗 根據(jù)《OIE診斷和疫苗標(biāo)準(zhǔn)操作指南》(OIE Standards Commission，2008) 常規(guī)微量法進行［6］．

1．2．2 SIV的亞型鑒定及命名

1．2．2．1 引物設(shè)計及病毒RNA提取 反轉(zhuǎn)錄通用引物 Uni12:5’-AGC AAA AGC AGG-3’．PCR 擴增引物分為通用引物和亞型引物2種．其中通用引物和H9亞型引物基于NCBI收錄的SIV序列采用Primer 5．0 自行設(shè)計，H1，H3，N1，N2 4 種亞型亞型引物參照CHOI等［4］的方法．引物均由上海英濰捷基公司合成，PAGE級純化，－20℃保存?zhèn)溆茫《綬NA提取參照Invitrogen Trizol LS Reagent試劑盒操作說明進行．

1．2．2．2 病毒cDNA合成及PCR反應(yīng)條件 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)說明書進行，依次加入各成分后，混合均勻，42℃保溫1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻備用．PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，延伸72℃ 2 min，運行30個循環(huán)后于72℃延伸10 min．反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定．

1．2．2．3 SIV命名 根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的流感病毒通用命名規(guī)則進行命名，S1V分離株名稱中包括型別(A，B，C)，分離宿主的類別/分離地名稱/毒株序號/分離年代(A型流感病毒還需標(biāo)注HA及NA抗原亞型)．

1．2．3 SIV有限稀釋克隆 將SIV第4代雞胚尿囊液進行10－2～10－8稀釋．每個稀釋度接種 SPF雞胚后，病毒血凝價達到8log2或8log2以上的最高稀釋度的雞胚尿囊液，即為該SIV分離株的稀釋克隆毒株．經(jīng)無菌檢驗后用1．5 mL eppendorf分裝，置－70℃保存?zhèn)溆茫飳W(xué)特性研究部分所用流感病毒株均為已純化的SIV稀釋克隆毒株．

1．2．4 SIV 生物學(xué)特性研究

1．2．4．1 SIV紅細胞凝集譜測定 用新鮮制備的雞、豬、豚鼠、兔、小鼠、綿羊、牛等動物的1%紅細胞懸液與新鮮收獲的病毒液進行HA試驗，測定紅細胞凝集譜．

1．2．4．2 S1V血凝素?zé)岱€(wěn)定試驗 將新鮮收獲的病毒液分裝于1．5 mL eppendorf管，每管0．5 mL，置于 56 ℃ 水浴處理 0，5，10，15，30，60，90，120，150，180，210 min及過夜，處理后迅速放到4℃冰箱5～10 min，分別測其HA效價．

1．2．4．3 脂溶劑敏感性及耐酸性試驗 參照等李玉萍等［7］方法，將經(jīng)乙醚、氯仿、0．1 mol·L－1鹽酸溶液及等量生理鹽水處理過的病毒液分別接種3枚雞胚，每枚0．2 mL，35℃孵育96 h，收集24～96 h內(nèi)死亡或未死雞胚尿囊液，測定HA效價．如處理組病毒液與對照組病毒液血凝價相差2個滴度以上，則判定病毒對其敏感．

1．2．4．4 雞胚半數(shù)感染量(EID50)和雞胚半數(shù)致死量(ELD50)試驗 將新收獲的病毒液用生理鹽水液l0倍倍比稀釋后，接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚SPF雞胚，每枚0．2 mL，并設(shè)生理鹽水對照組，35℃孵育96 h．每隔6 h照胚1次，棄去24 h死亡的雞胚，并統(tǒng)計雞胚死亡數(shù)目．收獲雞胚尿囊液，測定HA效價．按Reed－Muench法計算 EID50和 ELD50［8］．

1．2．4．5 細胞感染試驗 將1 mL新鮮病毒液接種至單層MDCK細胞，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃條件下孵育7 d，定期觀察細胞病變．

1．2．4．6 小鼠感染試驗 將新鮮病毒液10倍倍比稀釋，每一稀釋度經(jīng)滴鼻途徑接種1月齡BALB/c小鼠4只，每只0．1 mL，并設(shè)生理鹽水對照組．每天觀察小鼠臨床癥狀至感染后第14天．死亡小鼠采集內(nèi)臟進行SIV分離鑒定．未死亡小鼠采集血清，進行HI試驗．

2 結(jié)果與分析

2．1 SIV的分離與初步鑒定

病料上清液首次接種雞胚后，96 h內(nèi)無雞胚死亡．盲傳3代后，有3份尿囊液出現(xiàn)血凝性，HI檢測表明其均與抗ND陽性血清為陰性反應(yīng)．3份具有血凝性的尿囊液中的雞胚胎存在不同程度的全身性出血．

2．2 SIV亞型鑒定及命名

2．2．1 通用引物及亞型引物RT-PCR對SIV鑒定結(jié)果 提取3株病毒RNA，用NP基因通用引物進行RT-PCR擴增，電泳結(jié)果顯示擴增片段與預(yù)期片段大小相符，約為510 bp(圖1)．

圖1 SIV通用引物PCR產(chǎn)物電泳圖Fig．1 Identification of products by universal primers of SIV

亞型引物 RT-PCR鑒定結(jié)果顯示，3株毒株HA基因片段大小均約為1．0 kb，與H1亞型片段大小相符;NA基因片段大小約為500 bp，與N2亞型片段大小相符(圖2)．PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進一步顯示豬肺臟所獲分離株為H1N2亞型SIV．

圖2 SIV亞型引物PCR產(chǎn)物電泳圖Fig．2 Identification of products by subtype primers of SIV

2．2．3 SIV的命名 根據(jù)WHO公布的流感病毒通用命名法則，將分離到的3株豬流感病毒統(tǒng)一命名(表1)．

表1 豬肺臟中分離到的SIV命名Table 1 The names of SIV stains in the lung of pig

2．3 SIV生物學(xué)特性研究

2．3．1 病毒紅細胞凝集譜 A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)和A/Swine/HeNan/02/2010(H1N2)對雞、小鼠、豚鼠、兔、豬、綿羊和牛紅細胞均具有凝集性;但A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2)對豬和牛的紅細胞無凝集活性(表2)．

2．3．2 SIV血凝素?zé)岱€(wěn)定性測定 A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)屬于熱穩(wěn)定型，A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2)屬于中等熱穩(wěn)定型(表3)．

表2 3株SIV紅細胞凝集譜Table 2 Heamagglutination spectrum of SIV strains in this study

表3 SIV分離株血凝素?zé)岱€(wěn)定性測定結(jié)果Table 3 The stability of HA of SIV strains

2．3．3 脂溶劑敏感性和耐酸性試驗 將3株分離株按照上述方法經(jīng)氯仿、乙醚和酸處理后，接種雞胚，所收獲的尿囊液均檢測不到血凝價，說明3株分離株對氯仿、乙醚和酸敏感．

2．3．4 SIV分離株EID50和ELD50測定結(jié)果 根據(jù)Reed-Muench法，A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)EID50=10－7．16，ELD50=10－6．54;A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)EID50=10－5．86，ELD50=10－2．43;A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)EID50=10－3．83，ELD50=10－2．67．

2．3．5 細胞感染試驗 3株病毒株接種MDCK細胞后，均能感染細胞并造成細胞拉網(wǎng)脫落等病變．收集細胞液，血凝檢測和RT-PCR結(jié)果顯示，細胞液均具有血凝性，血凝價分別為1∶256，1∶32和1∶16．用NP通用引物進行RT-PCR擴增，結(jié)果顯示擴增片段約為510 bp，與先前擴增片段大小相符．

2．3．6 小鼠感染試驗 A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)，A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)，A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)在接種小鼠14 d內(nèi)，小鼠無明顯臨床癥狀、無死亡，對照組小鼠正常．剖檢后未見明顯病理變化，將小鼠肺臟研磨后接種雞胚，收集的尿囊液無血凝性．小鼠血清與SIVHI試驗為陰性結(jié)果．

3 小結(jié)與討論

目前，世界范圍內(nèi)豬群中流行的SIV亞型主要有H1N1，H3N2 和 H1N2 3 種［9］．對于河南地區(qū)，CONG等［10］從河南省有呼吸道癥狀的豬中分離到H9N2亞型SIV．段廷云［11］從河南地區(qū)豬場分離到1株H1N1亞型SIV，并建立了實時熒光定量PCR診斷方法．李春［12］從河南豬病料中分離到1株H1N1亞型流感病毒;趙樸等［13］對河南省5個不同豬場采集病料，分離到3株H3N2亞型SIV．本研究所分離的3株毒株均為H1N2亞型SIV，為首次報道證實在河南地區(qū)存在H1N2亞型SIV，該結(jié)果對河南省乃至中國的豬流感的防治和監(jiān)測具有重要的指導(dǎo)意義．

病毒的有限稀釋克隆純化是為了防止沒有血凝活性的病毒污染造成雞胚的非正常死亡，以及排除生物學(xué)特性及分子生物學(xué)試驗中的非特異性反應(yīng)，因此本研究將分離到的3株SIV毒株進行有限稀釋克隆法純化．其中 A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)進行多次有限稀釋純化后，其血凝價仍較低，其原因有待進一步研究．SIV血凝性具有重要的流行病學(xué)和生態(tài)學(xué)意義．A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)和A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)能夠凝集雞、小鼠、兔、豬、豚鼠、綿羊和牛的紅細胞，A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)不能凝集豬和牛的紅細胞．SIV的血凝性易受溫度影響，一般而言，熱穩(wěn)定型毒株在自然條件下存活能力相對較強，將有更多的機會通過不同途徑在同一或不同宿主間傳播．本研究結(jié)果顯示A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)和A/Swine/Henan/02/2010(H1N2)表現(xiàn)為熱穩(wěn)定型，A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)為中等熱穩(wěn)定型．說明前兩個毒株對自然條件的抵抗力較高，具有更大的危害性．

EID50和ELD50是反映SIV生物學(xué)特性最常考慮的2個指標(biāo)，與毒株的致病力有一定的關(guān)系［8］．本試驗中毒株A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)EID50較高，說明該分離株適應(yīng)于雞胚增殖，而A/Swine/Henan/03/2010(H1N2)較低，說明此毒株在雞胚中不能很好的增殖，制作成疫苗較困難．A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)ELD50較高，其對雞胚有較高的致死性，說明該毒株對雞胚的致病性較強．

小鼠感染試驗中，3個毒株接種小鼠后，均未觀察到明顯臨床癥狀，精神、采食和飲水均正常．剖檢后未見明顯病理變化．將小鼠肺臟研磨后接種雞胚，收集的尿囊液無血凝性，說明SIV毒株未感染小鼠，推測毒株對小鼠無致病性．這與王連想等［8］報道的H1N1感染小鼠結(jié)果一致．而SHIN等［14］經(jīng)鼻腔內(nèi)接種法給6～8周齡 BALB/c小鼠接種H1N2，H3N1，H3N2不同亞型的 SIV，接種后小鼠均出現(xiàn)精神萎靡不振、畏寒、呼吸短促、被毛松亂等臨床癥狀，并且能從肺臟中分離出病毒，這可能是由于不同亞型或分離株對小鼠的致病性不同造成的．

本試驗從河南地區(qū)首次分離到3株H1N2亞型SIV毒株并闡述了其生物學(xué)特性，該結(jié)果對河南省豬群中SIV的防治具有一定的指導(dǎo)意義，而所獲SIV分離株各基因片段來源及遺傳演化分析等信息對則需進一步深入研究．

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