韓同麗，牛蘇燕，鄧敏捷，范國強

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所，河南鄭州450002)

利用花藥誘導(dǎo)單倍體是利用現(xiàn)代生物技術(shù)進行植物品種選育的方法之一．單倍體能夠在相對較短的時間內(nèi)使性狀得以純合，在很大程度上縮短植物育種進程［1］，提供多倍體育種材料，提高目標新種質(zhì)獲得的機率和育種效率．佐藤亨［2］對楊樹的花藥進行了離體培養(yǎng)，并獲得了再生植株．王敬駒等［3］通過花藥培養(yǎng)成功獲得黑楊單倍體植株。隨著花藥培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，目前在林木研究中已獲得了6科7屬約40余個種的單倍體植株［4］．泡桐是中國重要的速生用材和綠化樹種，具有材質(zhì)好、易加工、用途廣等特點．但由于種質(zhì)資源匱乏、遺傳背景窄等緣故，限制了泡桐新品種的培育．豫雜一號泡桐生長迅速，抗病力強，是優(yōu)良的種質(zhì)資源，對其進行花藥培養(yǎng)有利于泡桐種質(zhì)資源的創(chuàng)新．關(guān)于泡桐花藥培養(yǎng)研究的報道較少，只有臺灣泡桐［5］和蘭考泡桐［6］花藥培養(yǎng)研究的報道．基因型是影響花藥培養(yǎng)的主要因素之一，不同基因型植株的花藥對培養(yǎng)的反應(yīng)不同［7，8］．本研究以豫雜一號泡桐花藥為試驗材料，對影響泡桐花藥愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因子進行探索，旨在為加速泡桐花藥遺傳改良和新品種培育提供依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗材料為2011-03-10采集于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)用醋酸洋紅染色確定花粉處于單核靠邊期的豫雜一號泡桐(Paulownia tomentosa×Paulownia fortunei)花蕾．

1．2 試驗方法

1．2．1 花蕾低溫預(yù)處理 將花蕾放入4℃冰箱，低溫預(yù)處理0，3，5，7 d后接入MS基本培養(yǎng)基附加NAA 3．0 mg·L-1，6-BA 5．0 mg·L-1的培養(yǎng)基上．在溫度為(25±2)℃，光照強度130 μ mol·m-2·s-1，光照時間16 h·d-1的培養(yǎng)室內(nèi)進行愈傷組織的誘導(dǎo)，25 d后統(tǒng)計出愈率．

1．2．2 初代培養(yǎng)消毒方式優(yōu)化 將花蕾在自來水下沖洗3～4 min后瀝干，迅速剝?nèi)セɡ偻鈱踊ㄝ?，放入體積分數(shù)70%乙醇中分別浸泡0，30，60 s;無菌水反復(fù)沖洗5次后，在體積分數(shù)為0．1%的HgCl2中分別浸泡60 s和120 s．浸泡處理結(jié)束后，用無菌水沖洗5次，置于無菌濾紙上，吸去多余水分．剝除雛形花冠后用鑷子輕輕除掉花絲，擠出完整花藥備用．每個處理20瓶，每瓶接種8枚花藥，3次重復(fù)．7 d后統(tǒng)計各處理的污染率，20 d后統(tǒng)計各處理的褐化率，計算平均污染率和平均褐化率．

1．2．3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

1．2．3．1 蔗糖質(zhì)量濃度 將無菌花藥接種于附加質(zhì)量濃度為 10，30，60，90，120 g·L-1蔗糖的 MS+NAA 3．0 mg·L-1+6-BA 5．0 mg·L-1培養(yǎng)基上，14 d和25 d時分別統(tǒng)計出愈率和生長情況確定花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最適蔗糖質(zhì)量濃度．

1．2．3．2 激素質(zhì)量濃度 以 M S為基本培養(yǎng)基(聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量濃度為1．5 g·L-1，蔗糖質(zhì)量濃度為 3 0 g·L-1)，附加質(zhì)量濃度為 0 ，0．5，1．0，2．0，3．0，4．0 mg·L-1NAA 和 2 ．0，3．0，4．0，5．0 mg·L-16-BA．將無菌花藥接種于培養(yǎng)基上，每個處理20瓶，每瓶接種8枚花藥，每6 d統(tǒng)計1次愈傷組織誘導(dǎo)率(產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)/接種花藥總數(shù)×100%);30 d時根據(jù)誘導(dǎo)率和生長情況確定花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基．

1．3 數(shù)據(jù)處理所有試驗數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成反正弦后采用DPS(Version 7．05)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 低溫預(yù)處理對花藥愈傷組織的影響

不同低溫預(yù)處理時間對愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的影響(表1)，隨著低溫預(yù)處理時間的延長，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率顯著增高，尤其以經(jīng)過7 d的低溫預(yù)處理時，花藥出愈率最高，達到61．04%，且愈傷組織質(zhì)地致密，顏色深綠色(圖1-A)．說明經(jīng)過一定時間低溫預(yù)處理可提高豫雜一號泡桐的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率．

表1 4℃預(yù)處理對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of 4℃on the Callus induction

2．2 不同消毒方式對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

隨著消毒時間的延長，污染率降低，同時褐化率升高(表2)．花藥培養(yǎng)5 d左右，部分花藥開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象．乙醇消毒60 s，HgCl2消毒60 s可以使污染率降低到0．培養(yǎng)20 d后，6號消毒處理褐化率最高，部分花藥完全褐化甚至死亡．說明消毒劑在作用一段時間后，外植體表面所帶的微生物基本上被消毒劑處理干凈，延長消毒時間并不能帶來顯著的效果．可能是外植體在消毒劑中浸泡時間過長，消毒劑滲入到外植體組織內(nèi)，在培養(yǎng)的過程中，由于消毒劑的毒害，嚴重阻礙外植體的代謝生長導(dǎo)致外植體的死亡．污染率與褐化率統(tǒng)計表明，最佳消毒方式是體積分數(shù)70%乙醇消毒30 s，體積分數(shù)0．1%HgCl2消毒60 s．

2．3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

2．3．1 蔗糖質(zhì)量濃度對花藥愈傷組織的影響 隨著蔗糖質(zhì)量濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率也逐漸升高(表3)．蔗糖質(zhì)量濃度從10 g·L-1增至120 g·L-1時，愈傷組織誘導(dǎo)率顯著增加．在蔗糖濃度為30 g·L-1時，愈傷組織的質(zhì)地和顏色都明顯優(yōu)于其他處理的愈傷組織(圖1-B)．當大于60 g·L-1時，形成的愈傷組織生長速度緩慢，質(zhì)地疏松，顏色淡黃，并且隨著生長會逐漸褐化直至死亡．說明高質(zhì)量濃度的蔗糖可以提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但對愈傷組織的生長有抑制作用，所以最適蔗糖質(zhì)量濃度為 30 g·L-1．

表2 消毒方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of disinfection methods on the Callus induction

表3 蔗糖質(zhì)量濃度對花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Table 3 Effect of concentration of sucrose on the induction rate of anther calli

2．3．2 激素質(zhì)量濃度對花藥愈傷組織的影響 豫雜一號泡桐花藥接種4～5 d后，部分花藥局部變褐，少量不褐化花藥開始膨大并伴有明顯的發(fā)綠現(xiàn)象．7 d后，部分花藥囊開裂處可以觀察到白色水滴狀透明愈傷組織的生成．12 d后，膨大發(fā)綠花藥及部分褐色花藥囊開裂處或花藥與花絲相連處陸續(xù)產(chǎn)生淡黃色顆粒狀愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的增加，花藥愈傷組織逐漸增大．將花藥接種在附加NAA，6-BA不同質(zhì)量濃度配比的MS基本培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)情況及生長情況不同(表4)．在NAA質(zhì)量濃度相同的條件下，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增大愈傷組織誘導(dǎo)率先增大后減小，6-BA質(zhì)量濃度過低生長慢，過高則對組織有毒害作用．當6-BA達到5 mg·L-1時，愈傷組織從中部褐化;在不含NAA的情況下，能夠誘導(dǎo)出少量愈傷組織，這可能是在花藥內(nèi)源激素作用下產(chǎn)生的，但生長緩慢，隨時間的變化而褐化至死亡;以NAA 2 mg·L-1+6-BA 3 mg·L-1組合處理誘導(dǎo)率最高(圖1-C)，愈傷組織質(zhì)地可明顯分為淺綠色顆粒狀、黃綠色疏松和深綠色緊密狀3種狀態(tài)．

圖1 豫雜一號泡桐花藥愈傷組織Fig．1 Anter calli from Paulownia tomentosa × Paulownia fortunei

3 小結(jié)與討論

在一些植物的花藥培養(yǎng)中，一定時間的低溫預(yù)處理被認為是必不可少的［9］．本試驗中，隨著低溫預(yù)處理時間的延長愈傷組織誘導(dǎo)率顯著增高，褐化現(xiàn)象略有減輕，尤其以低溫處理7 d時花藥愈傷組織誘導(dǎo)率達到最高，表明低溫預(yù)處理有利于提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率．王震星等［10］進行棗的花藥離體培養(yǎng)、李建安等［11］對油茶花藥培養(yǎng)愈傷組織和王敬東等［12］對寧夏棗樹花藥離體培養(yǎng)時也得到類似的結(jié)果．

表4 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 Effect of hormone on the induction rate of anther calli

外植體的消毒在花藥培養(yǎng)中是十分重要的．在花藥培養(yǎng)中，常用的表面消毒劑有體積分數(shù)70%乙醇、體積分數(shù) 0．1%HgCl2、漂白粉、次氯酸鈣等［13］．乙醇效果較好，但對外植體傷害嚴重;HgCl2對外植體傷害比較輕，一般時間越長，消毒效果越好，但褐化也越嚴重［14］．在本試驗中，考慮到花藥本身的特殊性，花藥由最外層肥厚多毛的花萼，里層的雛形花冠緊緊包裹，形成一個相對無菌的條件．因而在剝?nèi)セㄝ嗪罅⒓词褂孟緞┨幚頍o須過長時間即可保證消毒效果．接種時只需在超凈工作臺中除去外層花冠，操作方便簡單，節(jié)省時間．

蔗糖除了做碳源外，在培養(yǎng)基中還起著調(diào)節(jié)滲透壓的重要作用［15］．提高蔗糖質(zhì)量濃度可以增加培養(yǎng)基的滲透壓，抑制花藥壁等體細胞形成愈傷組織，增加花粉粒形成單倍體愈傷組織的頻率，有效地提高植物花藥培養(yǎng)的成功率，但是滲透壓過高對單倍體愈傷組織的誘導(dǎo)和生長具有抑制作用［16］．本試驗的結(jié)果表明隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸提高，當大于60 g·L-1時，形成的愈傷組織生長速度緩慢，質(zhì)地疏松，隨著生長會逐漸褐化直至死亡．因而當獲得愈傷組織后，應(yīng)及時降低滲透壓，降低糖源的質(zhì)量濃度，以加快愈傷組織的增殖．

在植物花藥培養(yǎng)中，外源激素種類及比例對花藥愈傷組織的形成和生長狀況起重要作用［17，18］．本試驗中以MS+2 mg·L-1NAA+3 mg·L-16-BA組合培養(yǎng)花藥愈傷組織生長狀況、質(zhì)地最好．愈傷組織培養(yǎng)30 d之后，隨著時間的延長，會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，可能是細胞代謝造成的滲出物積累加劇了愈傷組織的褐化，減短培養(yǎng)基更換周期可減少這一現(xiàn)象的發(fā)生．

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