李冠甲，王志強，梁威威，林同保

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002)

由于受季風(fēng)氣候影響，中國小麥生長季節(jié)恰逢旱季，干旱已成為限制小麥產(chǎn)量進一步提升的主要非生物逆境之一．干旱對植物的傷害很大程度上是破壞生物膜的生理功能而引起的［1］．正常條件下，植物體內(nèi)的活性氧(ROS)及其清除體系之間存在動態(tài)平衡，植物體內(nèi)存在的超氧化物保護酶(SOD)可使植物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O—·2)歧化生成活性較弱的H2O2和O2，然后再由過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等將H2O2還原為水，從而降低體內(nèi)活性氧的積累，防御膜脂過氧化，維持體內(nèi)正常的生理功能［2］．干旱等多種逆境脅迫會打破植物體內(nèi)的活性氧動態(tài)平衡，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)的O—·2，H2O2和·OH等活性氧自由基積累、膜脂過氧化作用加強［3］、生物膜受到傷害，最終降低作物產(chǎn)量．有關(guān)膜脂過氧化反應(yīng)與保護酶(SOD，POD，CAT等)活性變化的研究已被廣泛用于植物對逆境反應(yīng)機理的研究［4］，多年來都有報道［5～7］．研究表明，植物的抗旱性與其抗氧化能力有關(guān)［8］，干旱脅迫能引起植物體內(nèi)SOD，CAT和POD活性的變化［9～11］，在輕度干旱脅迫下，植物 SOD，CAT和POD活性升高，重度干旱脅迫下隨脅迫時間延長呈先升高后下降趨勢［9，10］．抗氧化能力的高低可反應(yīng)植物抗旱性的強弱［12］，但不同植物、不同干旱程度，植物SOD，CAT和POD的響應(yīng)也有所差別．目前，以不同抗旱性小麥品種為材料，研究其抗氧化保護系統(tǒng)的差異還鮮見報道，為此，研究采用聚乙二醇6000(PEG－6000)滲透脅迫處理，研究了不同抗旱性小麥品種幼苗葉片抗氧化特性差異，以期為小麥抗旱分子調(diào)控和品種改良提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試小麥品種為抗旱性強的品種洛旱7號和抗旱性弱的品種豫農(nóng)202．選整齊一致的小麥種子用質(zhì)量分數(shù)0．1%HgCl2消毒10 min，用蒸餾水沖洗干凈，平鋪于3層濕潤濾紙上，放入25℃的黑暗培養(yǎng)箱中使其萌發(fā)，期間保持濾紙濕潤．3 d后轉(zhuǎn)入人工氣候箱中培養(yǎng)，每天光照12 h，光照度為110 μmol·m－2·s－1，晝夜溫度分別為 25 和 20℃．1 d后選取長勢均勻的小麥幼苗移栽入盛有營養(yǎng)液的小桶內(nèi)(直徑20 cm，深17 cm)，營養(yǎng)液(pH值6．8)的組成如下:2 mmol·L－1Ca(NO3)2，0．25 mmol·L－1KH2PO4，0．75 mmol·L－1K2SO4，0．65 mmol·L－1MgSO4，30 μmol·L－1FeCl3，2 μmol·L－1MnCl2，25 μmol·L－1H3BO3，0．5 μmol·L－1CuSO4，2 μmol·L－1ZnSO4和 0．1 μmol·L－1(NH4)6Mo7O24．

1．2 試驗設(shè)計

在小麥幼苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)液后第4天開始進行處理，試驗設(shè)3個處理，分別為對照(CK)、低滲透脅迫(PEG質(zhì)量濃度150 g·L－1，T1)和高滲透脅迫(PEG 質(zhì)量濃度300 g·L－1，T2)，處理5 d 后，選取生長一致的小麥幼苗進行相關(guān)指標的測定．重復(fù)3次．

1．3 測定項目及方法

1．3．1 生物量 取長勢一致的小麥幼苗10棵，用濾紙吸干表面水分后，放入105℃烘箱中殺青15 min，再調(diào)至75℃烘至質(zhì)量恒定，用1/1 000的電子天平直接稱量，換算成每棵小麥幼苗的干質(zhì)量．

1．3．2 酶液提取 取小麥葉片鮮樣0．5 g，用預(yù)冷10 mL 0．05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 值 7．8，內(nèi)含1 mmol·L－1EDTA、質(zhì)量分數(shù)2%聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨勻漿，取混合液3 mL在4℃，15 000 g下離心15 min上清液用于 SOD，POD，CAT的測定［13］．

SOD活性的測定采用NBT光化還原法［14］．

CAT 活性的測定［15］:反應(yīng)混合液(0．1 mol·L－1pH 值 7．0 磷酸緩沖液、0．1 μmol·L－1EDTA，0．1%H2O2)3 mL，最后加入 0．2 mL 酶提取液，迅速倒入比色杯中，立即測定240 nm下吸光值變化，每隔1 min讀數(shù)1次，共測定3 min．

POD 活性的測定［16］:反應(yīng)混合液(0．1 mol·L－1pH 值 6．0 磷酸緩沖液、3 mmol·L－1愈創(chuàng)木酚、10 mmol·L－1H2O2)3 mL，最后加入 0．21 mL酶提取液，迅速倒入比色杯中，立即測定470 nm下吸光值變化，每隔1 min讀數(shù)1次，共測定5 min．

1．3．3O—·2產(chǎn)生速率的測定［14］取小麥葉片鮮樣 0．5 g，用預(yù)冷 3 mL 0．05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 值 7．8，內(nèi)含 1 mmol·L－1EDTA、質(zhì)量分數(shù)2%聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨勻漿，混合液在4℃，10 000 g下離心10 min．取上清液0．5 mL加0．5 mL 0．05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 值7．8)，再加入0．1 mL 10 mmol·L－1鹽酸羥胺，在25 ℃下反應(yīng)1 h后，再加入1 mL 17 mmol·L－1磺胺和1 mL 7 mmol·L－1α －萘胺，在25 ℃下反應(yīng)20 min．測定530 nm的吸光值．用亞硝酸鈉做標準曲線．

1．3．4 H2O2含量的測定［17］取小麥葉片鮮樣0．5 g，用3 mL質(zhì)量分數(shù)3%TCA冰浴研磨勻漿，于4℃，12 000 g下離心15 min，用1 mL上清液加入1 mL，0．1 mol·L－1磷酸鉀緩沖液(pH 值7．0)，再加2 mL 1 mol·L－1KI溶液，測定390 nm吸光值，根據(jù)標準曲線計算．

1．3．5 MDA含量的測定［18］取小麥葉片鮮樣0．5 g，用 5 mL 0．05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 值7．8)冰浴研磨勻漿，10 000 g，4 ℃下離心 20 min，取1 mL上清液加入2 mL 0．6%TBA沸水浴中煮15 min，迅速冷卻，4 000 r·min－1下離心 10 min，測定上清液600，532，450 nm的吸光值．

1．4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進行處理和制圖，采用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計分析，多重比較采用LSD法(P=0．05)．

2 結(jié)果與分析

2．1 滲透脅迫下不同抗旱性小麥品種幼苗生物量的變化

由圖1可以看出，小麥幼苗生物量隨脅迫程度逐漸降低，不同抗旱性品種之間存在差異．處理間相比，抗旱性強的洛旱7號降幅小于抗旱性弱的豫農(nóng)202．在低滲透和高滲透脅迫下，豫農(nóng)202的生物量分別比對照降低了24．3%和49．8%，洛旱7號分別比對照降低了18．7%和48．6%．

圖1 滲透脅迫對不同抗旱性小麥品種幼苗生物量的影響Fig．1 Effect of osmotic stress on biomass of wheat seedlings with different drought resistant variety

2．2滲透脅迫下不同抗旱性小麥品種幼苗產(chǎn)生速率和H2O2含量的變化

由圖2可以看出，滲透脅迫下，O—·2產(chǎn)生速率均有所增加．抗旱性強的洛旱7號在高滲透脅迫下比對照增加了54．34%，增加幅度顯著;而低滲透脅迫下增幅不明顯，為13．96%．抗旱性弱的豫農(nóng)202在滲透脅迫下增幅顯著，并隨脅迫程度加大，增幅加大，在低滲透和高滲透脅迫下分別增加了30．85%和 73．57%．

小麥幼苗H2O2含量隨滲透脅迫程度的加重而增加，但不同脅迫程度下增幅均不明顯，豫農(nóng)202和洛旱7號在低滲透脅迫下增幅分別為5．7%和2．76%;在高滲透脅迫下分別為 15．54%和14．52%．就不同品種之間來說，抗旱性弱的豫農(nóng)202增加幅度大于抗旱性強的洛旱7號．

2．3 滲透脅迫下不同抗旱性小麥品種幼苗SOD，POD和CAT活性的變化

由圖3可以看出，小麥葉片SOD活性均隨滲透脅迫程度的加重而增加，不同品種增加幅度有所差異．方差分析表明，抗旱性弱的豫農(nóng)202在低滲透脅迫下為對照的1．32倍，增加不顯著;在高滲透脅迫下為1．91倍，增加顯著;抗旱性強的洛旱7號在滲透脅迫下均顯著增加，低滲透和高滲透脅迫下分別為對照的1．35和2．08倍．從不同品種看，抗旱性強的洛旱7號大于抗旱性弱的豫農(nóng)202．

POD活性變化趨勢與SOD變化一致(圖3)．抗旱性弱的豫農(nóng)202在低滲透脅迫下是對照的1．07倍，增加不顯著;在高滲透脅迫下是對照的2．03倍，增加顯著．抗旱性強的洛旱7號在低滲透和高滲透脅迫下均顯著增加，分別為對照的1．39和2．47 倍．

滲透脅迫下，小麥幼苗CAT活性均增加，但不同抗旱性品種增幅不同，抗旱性強的洛旱7號在不同滲透脅迫下均高于抗旱性弱的豫農(nóng)202．抗旱性弱的豫農(nóng)202在低滲透和高滲透脅迫下分別是對照的1．20和1．08倍，增加不顯著．抗旱性強的洛旱7號在低滲透脅迫下增加顯著，是對照的1．26倍，在高滲透脅迫下增加不明顯．

2．4 滲透脅迫下不同抗旱性小麥品種幼苗丙二醛含量的變化

由圖4可以看出，小麥幼苗MDA含量在滲透脅迫下呈增加趨勢，增加顯著．抗旱性強的洛旱7號在對照、低滲透和高滲透脅迫下MDA含量均高于抗旱性弱的豫農(nóng)202，比其分別高20%，8%和5%．但滲透脅迫下洛旱7號增幅要小于豫農(nóng)202，低滲透和高滲透脅迫下，前者分別是對照的1．47和1．82 倍，后者分別是1．63 和2．09 倍．

圖4 滲透脅迫對不同抗旱性小麥品種幼苗MDA含量的影響Fig．4 Effect of osmotic stress on MDA concentration of wheat seedlings with different drought resistant variety

3 結(jié)論與討論

滲透脅迫下小麥幼苗生物量明顯降低，抗旱性弱的豫農(nóng)202降幅高于抗旱性強的洛旱7號，尤其在高滲透脅迫下表現(xiàn)更為明顯．超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率在滲透脅迫下均有所增加，豫農(nóng)202增幅高于洛旱7號．自由基傷害學(xué)說認為，植物在干旱等逆境因素下體內(nèi)活性氧自由基大量積累，能啟動自由基鏈式反應(yīng)及其他類型的再氧化等產(chǎn)生羥基自由基、單線態(tài)氧和過氧化氫［19］．這些活性氧能直接或間接的啟動細胞膜脂質(zhì)過氧化作用，膜脂過氧化作用可直接導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，進而影響到植物的生理生化代謝和其他生長過程．由此推測，滲透脅迫下活性氧自由基的大量積累是植物生長受抑制的原因之一，抗旱性強的品種表現(xiàn)為對其較高的適應(yīng)性和強的清除能力．

丙二醛是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量高低反映了活性氧代謝及對細胞膜破壞的程度［20～21］．本試驗顯示，滲透脅迫下2種小麥品種幼苗的MDA含量、產(chǎn)生速率和H2O2含量均有所增加，表明了細胞內(nèi)等活性氧自由基積累增加，細胞內(nèi)活性氧積累和清除之間的平衡遭到了破壞，對細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞作用增強;抗旱性弱的豫農(nóng)202小麥品種幼苗MDA含量和O—·2的產(chǎn)生速率在滲透脅迫下增加幅度均比較明顯，而抗旱性強的洛旱7號只有在重度干旱下增幅顯著，H2O2含量雖然在滲透脅迫下增加不明顯，但豫農(nóng)202增幅大于洛旱7號，這表明和抗旱性弱的品種相比，抗旱性強的品種細胞內(nèi)活性氧自由基積累少，細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞小，說明其體內(nèi)有強的清除能力，應(yīng)該和清除活性氧的酶類有關(guān)．

正常情況下，植物細胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡，不易產(chǎn)生膜脂過氧化［22］．當植物處于各種逆境下活性氧積累過多，會使膜脂產(chǎn)生脫酯化作用，磷脂游離，膜結(jié)構(gòu)遭破壞．SOD，CAT和POD是細胞內(nèi)清除活性氧的主要酶類，對活性氧清除能力是決定細胞對脅迫抗性的關(guān)鍵因素，整個活性氧清除酶系統(tǒng)防御能力的變化取決于這幾種酶彼此協(xié)調(diào)的綜合結(jié)果［23，24］．試驗結(jié)果表明，2種小麥品種在不同程度的滲透脅迫下，此3種保護酶均有所提高，與前人研究結(jié)果一致［25～27］．方差分析表明，2種小麥品種幼苗葉片SOD，POD和CAT活性，在低滲透脅迫下，抗旱性強的洛旱7號顯著高于對照，而抗旱性弱的豫農(nóng)202增加不明顯，結(jié)合前面滲透脅迫下抗旱性強的品種活性氧自由基積累少，膜脂過氧化弱說明增強SOD，POD和CAT活性與提高小麥對滲透脅迫的抗性有關(guān)．高滲透脅迫下，CAT活性增加不顯著，可能是由于活性氧的大量積累抑制了酶活性提高，而SOD和POD活性增加顯著，加上此時H2O2含量增加亦不明顯，說明其主要原因可能是重度干旱下H2O2的清除依賴于SOD和POD，但仍需進一步研究．

綜上所述，抗旱品種可能由于在滲透脅迫下具有較高的抗氧化酶活性，從而提高抗逆性．由于抗氧化酶活性較低，抗旱性弱的品種活性氧積累較高，膜脂過氧化作用增強，從而使抗旱性降低，與劉曉忠等［28］在玉米上的結(jié)果一致．所以，提高SOD，POD和CAT活性能提高小麥抗旱性．

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