王風(fēng)芹，侯淑芬，謝 慧，于魯冀，宋安東

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002;2．農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002;3．鄭州大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院，河南鄭州450002)

賈魯河是淮河的二級(jí)支流，發(fā)源于河南省新密市白寨鄉(xiāng)圣水峪，流經(jīng)鄭州、中牟、開封、尉氏縣，于周口市入沙潁河，全長276．5 km，總流域面積5 896 km2［1］．賈魯河無清水來源，沿途又接納鄭州市和中牟縣的生活污水及工農(nóng)業(yè)廢水，造成其水體污染嚴(yán)重，自凈能力差，水質(zhì)屬劣Ⅴ類，氨氮及COD的排放量占沙穎河的1/3，已成為沙潁河流域污染最嚴(yán)重的河流，被國家和河南省政府列為流域環(huán)境綜合重點(diǎn)整治區(qū)域［2，3］．微生物作為水質(zhì)評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)，能及時(shí)反映整個(gè)水生環(huán)境的變化［4］，對(duì)河流水體中的脫氮微生物數(shù)量進(jìn)行檢測，可以間接反映該水域的脫氮能力與自凈能力．本研究利用傳統(tǒng)的微生物分離計(jì)數(shù)方法和DGGE技術(shù)研究了賈魯河水體及底泥微生物種群結(jié)構(gòu)與多樣性的季節(jié)動(dòng)態(tài)變遷特征，以期為制定賈魯河污水的生物治理方案提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 樣品采集

選取賈魯河鄭州示范工程第七標(biāo)段上游和下游作為2個(gè)取樣點(diǎn)，于2009-03—2009-12的春分、夏至、秋分、冬至4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，參照文獻(xiàn)［5］的方法，分別取河流水體(距水表面0～40 cm，5點(diǎn)取樣混合均勻)和底泥(0～20 cm，5點(diǎn)取樣混合均勻)以備試驗(yàn)．

1．2 微生物區(qū)系分析

1．2．1 細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量測定 采用梯度稀釋平板法測定水樣和底泥樣品中的細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量．培養(yǎng)基分別選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基，于28～30℃，分別培養(yǎng)2～3 d、3～5 d和5～7 d，計(jì)數(shù)并記錄結(jié)果．

1．2．2 脫氮功能微生物數(shù)量測定 采用最大或然數(shù)法(Most Probable Number，MPN)測定硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌等脫氮功能微生物菌數(shù)．培養(yǎng)基分別采用硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基．樣品稀釋梯度為 10-2，10-3，10-4，10-54 個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，接種量0．1 mL，并以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，28～30℃靜置培養(yǎng)14 d后進(jìn)行測定，培養(yǎng)基配方及試驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)［6］，查MPN表，計(jì)算．

1．3 16S rDNA PCR-DGGE 分析

1．3．1 16S rDNA V3 區(qū) PCR 擴(kuò)增 采用 E．Z．N．A．TM Water/Soil DNA Kit Protocal(OMEGA)試劑盒提取水樣及底泥的宏基因組DNA，提取方法參照說明書．選用細(xì)菌的通用引物F341-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')［7～9］對(duì)水樣和底泥樣品的16s rDNA V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增．PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下:5 μL 10 × PCR Buffer(Mg2+15 mmol·L-1)、4 μL dNTP Mix(2．5 mmol·L-1)、1 μL 引物 F341-GC(10 μmol·L-1)、1 μL 引物 518 R(10 μmol·L-1)、0．5 μL Taq DNA 聚合酶、DNA模板10 ng，滅菌去離子水補(bǔ)至50 μL．PCR反應(yīng)條件為:95℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s，56℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，28個(gè)循環(huán);94℃下30 s，56 ℃下30 s，72 ℃下延伸7 min．PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1．0% 瓊脂糖凝膠檢測后，于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1．3．2 DGGE 將45 μL 的 PCR 產(chǎn)物和5 μL 6 倍加樣緩沖液混合，采用Bio-rad凝膠電泳系統(tǒng)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度為30%～60%(100%的變性劑含7 mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺)，在200 V的電壓下，電泳10 min，使樣品快速跑出泳道后再在85 V電壓下，60℃，電泳14 h．電泳結(jié)束后，采用SYBR GreenⅠ染色，獲得DGGE指紋圖譜．

1．3．3 目的條帶的克隆與測序 分別切取DGGE圖譜中的目的條帶至不同的EP管中，以100 μL 70%的冰乙醇洗滌，重復(fù)2～3次，風(fēng)干10 min后轉(zhuǎn)移至另一新的 EP管中，加50 μL滅菌去離子水，4℃靜置過夜;以此為模板，以 F341(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和 R518為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同1．3．1．PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠檢測后，送北京鼎國生物技術(shù)有限公司測序．將測序結(jié)果進(jìn)行處理后提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫，采用BLAST進(jìn)行目標(biāo)序列和基因庫中所含序列的相似性分析，得到同源性最近的序列．

2 結(jié)果與分析

2．1 賈魯河不同季節(jié)水體微生物數(shù)量分布

賈魯河鄭州段示范工程第七標(biāo)段上下游水體不同季節(jié)各類群微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)見表1．由表1可知，賈魯河水體中細(xì)菌數(shù)量最多，真菌次之，放線菌最少;上下游水體相比而言，細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量未呈現(xiàn)規(guī)律性變化;硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量基本相當(dāng)，且下游數(shù)量略高于上游．賈魯河水體中各類群微生物夏秋季數(shù)量高于冬春季．

表1 不同季節(jié)水體微生物數(shù)量Table 1 Microbe population in the water column with various seasons CFU·mL-1

2．2 賈魯河不同季節(jié)底泥微生物數(shù)量分布

賈魯河不同季節(jié)上下游底泥中微生物數(shù)量分布情況見表2．由表2可知，底泥中細(xì)菌數(shù)量最高，其次是放線菌，真菌數(shù)量最少;硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量基本相當(dāng)．除冬季外，下游底泥中細(xì)菌數(shù)量顯著高于上游數(shù)量;放線菌和真菌上下游數(shù)量之間差別不明顯;夏秋季下游脫氮功能微生物數(shù)量顯著高于上游，冬春季差別不明顯．細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量春夏季均略高于秋冬季，硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量夏秋季高于冬春季．底泥中微生物數(shù)量季節(jié)變化較水體中微生物數(shù)量季節(jié)變化穩(wěn)定．

表2 不同季節(jié)底泥微生物數(shù)量Table 2 Microbe population in the sediment with various seasons CFU·g-1

2．3 底泥樣品中細(xì)菌16S rDNA DGGE分析

2．3．1 16S rDNA DGGE指紋圖譜分析 擴(kuò)增底泥樣品中細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析，明顯可見各樣品數(shù)量不等、強(qiáng)度不同的條帶(圖1)，春、夏、秋、冬四季微生物種群結(jié)構(gòu)差異顯著，上下游底泥樣品在春、夏、秋、冬四季優(yōu)勢(shì)菌群均存在明顯的消漲變遷．

2．3．2 優(yōu)勢(shì)菌群鑒定結(jié)果 將DGGE圖譜中的5條優(yōu)勢(shì)目的條帶(圖1)回收、純化、測序，測得的16S rDNA V3區(qū)序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列用BLAST進(jìn)行檢索和同源性比較，結(jié)果見表3．

從表3可知，5個(gè)條帶中有4條在GenBank中找到與其同源性很高(＞98%)的相似種群．其中條帶1和條帶2為不可培養(yǎng)的未知種群細(xì)菌．條帶3與弓形菌屬(Arcobacter)親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)100%．條帶4和條帶5均為擬桿菌(Bacteroidetes)，該種群微生物是活性污泥和好氧顆粒污泥系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群，在賈魯河水體自凈過程中可能起到重要作用．

圖1 賈魯河不同季節(jié)總細(xì)菌DGGE圖譜Fig．1 DGGE profile of total bacteria in Jalu River various seasons

表3 DGGE優(yōu)勢(shì)條帶的16S rDNA片段序列的比對(duì)結(jié)果Table 3 Comparison of 16S rDNA sequences in dominant DGGE bands by sequencing and BLAST analysis

3 結(jié)論與討論

微生物監(jiān)測是利用微生物資源對(duì)環(huán)境污染或變化所發(fā)生的反應(yīng)，闡明環(huán)境污染狀況，從生物學(xué)角度為環(huán)境質(zhì)量的監(jiān)測和評(píng)價(jià)提供依據(jù)．它不僅能反映多種因子污染的綜合效應(yīng)，還能反映環(huán)境污染的歷史狀況，成為污染物的暴露與效應(yīng)最靈敏的監(jiān)測指標(biāo)，這對(duì)于環(huán)境污染的探查和快速篩選、環(huán)境健康的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及污染物長期毒性效應(yīng)的早期預(yù)報(bào)具有重要意義．

本研究發(fā)現(xiàn)賈魯河水體和底泥中細(xì)菌數(shù)量顯著高于真菌和放線菌數(shù)量，脫氮功能微生物硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量相當(dāng);水體中各類群微生物數(shù)量及底泥中硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量夏秋季高于冬春季，而底泥中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量春夏季略高于秋冬季．無論在水體還是底泥中，細(xì)菌總數(shù)在一年四季均達(dá)到了106CFU·mL-1以上，最高達(dá)到了109CFU·mL-1，表明賈魯河水質(zhì)一年四季均處于嚴(yán)重污染狀態(tài)，為多污染帶．這與賈魯河暗渠多，大量生活污水和生產(chǎn)廢水廢物不斷排入關(guān)系巨大．

吳春篤等［10］對(duì)鎮(zhèn)江城市污水細(xì)菌多樣性及其生物安全性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，近似弓形桿菌屬(Arcobacter)的細(xì)菌比例高達(dá)74．2%，為城市污水中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，進(jìn)一步將其23S rDNA上的特異性序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后證實(shí)污水中的弓形菌屬為致病性弓形桿菌．本研究利用16S rDNA PCR-DGGE指紋圖譜分析，揭示出賈魯河底泥中四季微生物種群結(jié)構(gòu)差異顯著，上下游底泥樣品在春、夏、秋、冬四季優(yōu)勢(shì)菌群均存在明顯的消漲變遷，且擬桿菌和弓形菌等是賈魯河底泥的優(yōu)勢(shì)微生物．弓形菌等致病性細(xì)菌的存在將威脅周邊群眾及畜禽的健康，因此對(duì)于賈魯河的污染治理應(yīng)引起政府和科研部門的極大關(guān)注，制定相應(yīng)的治理措施．

［1］ 盧 暇，蘇衛(wèi)濤，王 楠．賈魯河河道洪水計(jì)算［J］．河南水利與南水北調(diào)，2009(8):54．

［2］ 趙 輝，張建夫，謝東坡，等．賈魯河水質(zhì)的變化規(guī)律研究［J］．周口師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，22(5):68-70．

［3］ 高紅莉，李洪濤，趙鳳蘭．沙潁河(河南段)水污染的時(shí)空分布規(guī)律［J］．水資源保護(hù)，2010，26(3):23-26．

［4］ 陳國新．環(huán)境科學(xué)基礎(chǔ)［M］．上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，1992:259-261．

［5］ 國家環(huán)境保護(hù)總局．水和廢水監(jiān)測分析方法［M］．北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002:38-42．

［6］ 李振高，駱永明，滕 應(yīng)．土壤與環(huán)境微生物研究法［M］．北京:科學(xué)出版社，2008:92-103．

［7］ 劉恩科，趙秉強(qiáng)，李秀英，等．不同施肥制度土壤微生物量碳氮變化及細(xì)菌群落16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE 分析［J］．生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27(3):1079-1085．

［8］ NAKATSU C H，TORSVIK V，?VREáS L．Soil community analysis using DGGE of 16S rDNA polymerase chain reaction products［J］．Soil Science Society of A-merica Journal，2000，64:1382-1388．

［9］ MUYZER G，WAAL E C，UITTERLINDEN A G．Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］．Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700．

［10］ 吳春篤，許小紅，寧德剛，等．城市污水細(xì)菌多樣性及其生物安全性研究［J］．中國安全科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，18(1):119-122．