陳紅霞

(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

心肌缺血再灌注損傷(MRI)的概念最早由Jennings等［1］提出，在器官的缺血再灌注損傷中，心肌的缺血再灌注損傷發(fā)生率最高，也是目前研究最多的器官。再灌注損傷心肌可表現(xiàn)為心肌舒縮功能降低，再灌注性心律失常，心肌能量代謝紊亂和心肌超微結(jié)構(gòu)的改變。但是缺血再灌注損傷的具體機(jī)制尚未完全闡明。自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子與細(xì)胞凋亡等均可能參與缺血再灌注損傷的發(fā)生。大量的基礎(chǔ)研究證實(shí)缺血預(yù)處理能減少缺血再灌注損傷。研究表明人參皂苷Rb1有抗氧化，抗凋亡作用，并且能明顯縮小犬急性心肌梗死面積［2］，亦降低心梗大鼠血液粘度，還能降低心肌耗氧，改善冠脈循環(huán)［3～5］。但其對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制未明。本研究通過人參皂苷Rb1預(yù)處理缺血大鼠心肌，觀察心肌梗死面積及心肌一氧化氮合酶表達(dá)的影響，探討其減輕心肌缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雄性Wistar大鼠共40只，體質(zhì)量220～260g，由湖北科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品及試劑

人參皂苷Rb1(中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào):1130-050102，純度≥98%);逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒(TOYOBO公司，由上海譜振生物科技有限公司代購(gòu));隨機(jī)引物合成(Invitrogen公司)，TaqDNA聚合酶、dNTP(Promega公司，由上海玉博生物科技有限公司代購(gòu));MDA、SOD及NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

40只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、再灌注模型組及人參皂苷Rb150mg·kg-1·d-1和100mg·kg-1·d-1組，每組10只。藥物組每天灌胃給藥1次，連續(xù)7d，空白組及再灌模型組給予等體積生理鹽水。參照DREXLER［6］方法，復(fù)制梗死模型。乙醚麻醉大鼠，從左側(cè)胸骨旁第3～4肋間開胸?cái)D出心臟。在動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處高位結(jié)扎左前降支(LAD)后 ，將心臟放回原位，關(guān)閉胸腔。30min后松解LAD的結(jié)扎線，傷口局部給予青霉素粉劑抗感染，然后縫合皮膚。

1.4 心肌梗死范圍測(cè)量［7］

再灌注3h后再次阻斷冠狀動(dòng)脈血流，注射伊文思藍(lán)進(jìn)行心肌染色，以區(qū)分無(wú)藍(lán)色的缺血和藍(lán)色的非缺血組織。迅速將左室心肌取出切成約2mm的薄片，而后分離出未染色的心肌部分(無(wú)藍(lán)色)與染色部分(藍(lán)色)并用濾紙吸干，稱重，將缺血的心肌切片置于1%TTC磷酸緩沖液內(nèi)，確定梗死組織范圍大小。然后再將灰白色區(qū)域(壞死區(qū))和深紅色區(qū)域(非壞死區(qū))進(jìn)行分離后，分別測(cè)量并計(jì)算梗死/缺血的百分比(MIS)。

1.5 NO、SOD 活性及 MDA 含量的檢測(cè)［7］

取出處死后動(dòng)物的左心室缺血心肌并研磨成10%的組織勻漿，移入離心管中(3500rpm離心15min)，吸取上清液(移液槍)，4℃儲(chǔ)存。用 NO試劑盒測(cè)定心肌組織勻漿NO活性，用MDA試劑盒測(cè)定心肌組織勻漿MDA含量，SOD試劑盒檢測(cè)SOD的活性。檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書操作。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同組別心肌組織eNOS mRNA表達(dá)變化

引物序列設(shè)計(jì)如下:eNOS:296 bp，Sense:5＇TAGCTGTGCTGGCAT-ACAGG 3 ＇，Antisense:5 ＇ATGGTCAAGTTGG-GAGCATC 3 ＇;β-act in:159 bp，Sense:5＇CTTAGT-TGCGTTACACCCTTTCTTG 3 ＇，Antisense:5 ＇CT GCTGTCACCTTCACCGTTCC 3 ＇，反應(yīng)條件為:首先94℃ 3min變性，接著50個(gè)循環(huán)，包括94℃ 30s變性，56℃ 30s退火，72℃ 30s延伸，最后72℃ 7min延伸。全過程在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(FT C-2000)中完成，觀測(cè)并記錄擴(kuò)增曲線并分析Ct值，根據(jù)Ct值計(jì)算出各擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MIS及心肌組織SOD活性和MDA含量的變化

與空白組比較，再灌模型組大鼠MIS及MDA含量均顯著升高(P＜0.01);與再灌模型組比較，人參皂苷Rb150、100mg·kg-1組可見大鼠MIS明顯縮小 (P＜0.05或P＜0.01)，心肌組織MDA含量顯著降低 (P＜0.05或P＜0.01);與空白組比較，再灌模型組大鼠心肌組織SOD活性顯著下降(P＜0.01)，與再灌模型組比較，人參皂苷 Rb150、100 mg·kg-1組可見心肌SOD活性顯著升高(P＜0.05 或 P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠MIS變化和SOD及MDA含量比較(，n=10)

表1 各組大鼠MIS變化和SOD及MDA含量比較(，n=10)

與空白組比較，*P＜0.01;與再灌注組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 MIS(%) SOD(u/mg·ww) MDA(nmol/100mg·ww)0.36 ±0.49 6.13 ±0.65 3.76 ±0.23再灌注組 22.43 ±4.60* 4.67 ±0.79* 4.93 ±0.69*G-Rb150mg/kg組 14.98 ±4.31△ 5.98 ±0.96△ 3.95 ±0.61△G-Rb1100mg/kg組 13.89 ±4.72△△ 6.05 ±1.13△△ 3.81 ±0.36空白組△△

2.2 各組大鼠NO及eNOSmRNA表達(dá)的比較

與空白組比較，再灌模型組心肌組織NO及eNOSmRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，與再灌注模型組比較，人參皂苷Rb150、100mg·kg-1組可見心肌組織NO及eNOSmRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌組織NO及eNOSmRNA表達(dá)影響

3 討論

近年來(lái)心肌缺血再灌注損傷已經(jīng)成為溶栓及動(dòng)脈搭橋等冠脈再通術(shù)治療急性心肌梗死的重要難題之一，心肌缺血再灌注反而會(huì)加重心肌結(jié)構(gòu)的損傷和功能障礙，甚至引起嚴(yán)重心律失常、猝死和心室纖顫等現(xiàn)象。研究表明，心肌缺血再灌注損傷會(huì)進(jìn)一步加大MIS，其心功能障礙程度比急性心肌梗死還嚴(yán)重，病死率更高［8］。目前，缺血再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明，研究表明自由基、鈣超載、細(xì)胞凋亡、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞粘附分子與心肌纖維能量代謝障礙等均可能參與缺血再灌注損傷。臨床對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)方法都是外源性的，如增加心肌氧和能量供應(yīng)，減輕心臟負(fù)擔(dān)和能量消耗，但是所有的方法都有其不足和副作用。

經(jīng)多年實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用表明，人參及其提取物人參皂苷能夠改善心肌缺血、縮小梗死面積，并且對(duì)再灌注損傷有著較好的保護(hù)作用［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，人參及其提取物人參皂苷類藥物能夠上調(diào)eNOS進(jìn)而增加NO的合成，具有快速反應(yīng)性。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，人參皂苷Rb1對(duì)心肌細(xì)胞存在確切的保護(hù)作用，理?yè)?jù)如下:表1 中Rb150及100mg·kg-1組MIS均較缺血再灌注組小，而心肌組織MDA含量較再灌注組高，圖1中人參皂苷Rb1預(yù)處理組心肌SOD活性較再灌注組明顯增加。因此我們可以看出人參皂苷Rb1能夠通過上調(diào)eNOS的表達(dá)來(lái)抑制受損心肌細(xì)胞的壞死，從而發(fā)揮其藥效。但是目前無(wú)法確認(rèn)人參皂苷Rb1調(diào)控eNOS表達(dá)的具體途徑，其機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討。

［1］Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al.My ocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog［J］.ArchPathol，1960，70:68

［2］睢大員，陳滿秋，于曉風(fēng)，等.人參Rb組皂苷對(duì)犬實(shí)驗(yàn)性心肌梗死的保護(hù)作用［J］.中草藥，2001，32(2):136

［3］Wu Y，Xia ZY，Dou J，et al.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Mol Biol Rep，2011，38(7):4327

［4］覃秀川，睢大員，楊景文，等.人參Rb組皂甙對(duì)急性心肌梗死大鼠自由基代謝的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2002，22(3):51

［5］Thirunavukkarasu M，Han Z，Zhan L，et al.Adeno-sh-beta-catenin abolishes ischemic preconditioning-mediated cardioprotection by downregulation of its target genes VEGF，Bcl-2，and survivin in ischemic rat myocardium［J］.AntioxidRedox Signal，2008，10(8):1475

［6］Roque FR，Soci UP，De Angelis K，et al.Moderate exercise training promotes adaptations in coronary blood flow and adenosine production in normotensive rats［J］.Clinics(Sao Paulo)，2011，66(12):2105

［7］陳紅霞，趙小玉.普伐他汀配伍參麥注射液干預(yù)兔心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.咸寧學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，21(2):96

［8］谷騰飛，趙明，蔣鵬，等.參麥注射液對(duì)缺血-再灌注損傷大鼠心肌H-FABP和血清FFA的影響［J］.臨床麻醉學(xué)雜志，2011，27(6):590

［9］Kong HL，Li ZQ，Zhao YJ，et al.Ginsenoside Rb1 protectneonatal rat cardiocytes against CoCl2-induced apoptosis in neonatal rats by inhibiting mitochondria permeability transition pore opening［J］.Acta Pharmacot Sinica，2010，31(6):687