李 麗，馮 俊，王朝莉，敬保遷△

(1.川北醫(yī)學院病理教研室;2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻喉科;3.川北醫(yī)學院分子生物研究所，四川 南充 637007)

喉癌是頭頸部原發(fā)于上皮的常見惡性腫瘤之一，目前主要治療還是以手術和放射治療為主，放療可以充分保護喉的發(fā)聲功能。ATM是與放射敏感性有關的基因，ATM蛋白表達水平差異與細胞放射敏感性程度之間存在一定的關系［1］。本研究中，我們使用反義多核苷酸作用于ATM以研究ATM mRNA、蛋白表達。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)由四川大學華西醫(yī)院上呼吸道實驗研究中心惠贈。

1.2 試劑

Lipofectamine 2000、Opti-MEM I、Trizol kit購自美國Carlsbad公司;GAPDH單克隆抗體、SYBR Ex-Script RT-PCR Kit、SYBR Green Master Mix 試劑盒購自Takara公司;ATM單克隆抗體、BCIP/NBT購自美國Santa Cruz公司。

1.3 目標序列的選擇及多核苷酸的合成

于NCBIGenBank查出人ATM序列，設計反義ATM核苷酸(AS:5'-GTACTAGACTCATGGTTCACAATTT-3');正義ATM核苷酸(Sen:5'-AAATTGTGAACCATGAGTCTAGTAC-3');錯配 ATM核苷酸(Mis:5'-AAAATGTAAACCATAAGTCTAGAAC-3')。送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 PCR 引物設計

將GAPDH作為內參對照，按照引物設計原則進行設計，交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

表1 引物設計

1.5 多核苷酸轉染喉鱗狀細胞癌細胞

將生長良好的Hep-2約2×105，置于6孔板中培養(yǎng)，待其生長到70% ～80%時備用。取0.8 ug的反義ATM核苷酸、正義ATM核苷酸、錯配ATM核苷酸及Lipofectamine 2000分別加入到Opti-MEM I中，在常溫下作用5 min。而后將核苷酸與 Lipofectamine 2000在常溫下作用20 min后加入Hep－2細胞中，在37°C，5%CO2孵箱中作用。6 h后用PBS洗兩次。最后用RPMI-1640取代PBS，在37°C孵箱中過夜備用。

1.6 Western blot分析

收集1.5所述的細胞1×107，以冷 PBS清洗3次，以裂解緩沖液制備細胞總蛋白，總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，然后轉膜(硝酸纖維素膜)，用5%的脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜上的蛋白潛在結合位點，加入ATM單克隆抗體(1∶100)4℃過夜，GAPDH作為陽性對照，加入二抗后BCIP/NBT試劑顯色、照相。

1.7 real-time quantitative PCR 分析

收集1.5所述的細胞，按Trizol試劑盒說明書提取hep-2細胞總RNA，然后進RNA電泳，反轉錄合成cDNA，隨后進行目的基因ATM和內標基因GAPDH Real Time PCR。擴增條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s、60℃ 1 min，42個循環(huán)，每組及內標均設3個復孔。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Western Blot檢測轉染AS-ODNs后hep-2細胞中ATM蛋白表達

將多核苷酸AS、Sen、Mis轉染喉鱗狀細胞癌細胞后，進行Western blot分析。從圖1可以看出AS組蛋白表達明顯較 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質體)組蛋白表達低，從圖2(各組蛋白表達的灰度掃描)可以更準確的得出 AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2組(對照組)的蛋白相對表達量以AS-lipo組最低，為(48.14±5.53)%。用SPSS 18.0軟件分析各組蛋白表達灰度可以得出，AS組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較有統(tǒng)計學意義。Sen、Mis、lipo、hep-2組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 Real-time quantitative PCR檢測轉染ATM ASODNs后hep-2細胞中ATM mRNA的表達

將多核苷酸AS、Sen、Mis轉染喉鱗狀細胞癌細胞后，進行PCR分析，從圖3可以看出AS組mRNA表達明顯較 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質體)組 mRNA 表達低，AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2 組(對照組)的 mRNA相對表達量以 AS-lipo組最低，為(11.03±2.51)%，用SPSS 18.0軟件分析各組mRNA表達可以得出，AS 組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較差異有統(tǒng)計學意義。Sen、Mis、lipo、hep-2組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

參與DNA損傷修復磷酸化過程的蛋白包括ATM、P53等在乳腺癌、結腸癌、睪丸癌、肺癌、皮膚癌以及膀胱癌等的早期階段就能檢測得到［2－4］，這就暗示在腫瘤的早期階段就會發(fā)生DNA損傷，甚至在許多腫瘤的野生型P53基因功能失活和基因組不穩(wěn)定性改變之前就已出現(xiàn)。Raju［5］證實P53基因對原癌基因的過表達作出反應需要ATM激酶—一個對DNA雙鏈斷裂做出反應的主要調節(jié)劑。Mohammad A［6］推測在成人的急性淋巴細胞型白血病的誘導和緩解期，ATM缺乏能增加化療藥物對白血病治療的敏感性。Jian等［7］通過反義多核苷酸作用于小鼠頭頸鱗癌細胞株(SCCⅦ)ATM基因，從而增強了頭頸鱗癌細胞對放射線的增敏性。江繼平等［8］用ATM反義多核苷酸降低了喉癌細胞ATM蛋白的表達。因此，我們設計ATM反義多核苷酸從不同成面來驗證反義ATM能否抑制喉鱗狀細胞癌ATM的表達。

本研究顯示，進行Western blot分析可以看出AS組蛋白表達明顯較Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質體)組蛋白表達低，為48.14% ±5.53%，AS組與 Sen、Mis、lipo、hep-2組比較差異有統(tǒng)計學意義。PCR分析可以看出AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2組(對照組)的mRNA相對表達量以 AS-lipo組最低，為(11.03 ±2.51)%，AS 組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較差異有統(tǒng)計學意義。檢測結果表明轉染反義ATM組的ATM蛋白和ATM mRNA的表達明顯低于轉染正義ATM組、無關序列組及對照組，這就表明ATM表達的抑制是由于反義ATM多核苷酸序列介導的。因此，將反義ATM多核苷酸轉染喉鱗狀細胞癌可以抑制ATM mRNA和ATM蛋白的表達水平。已有研究［1］表明，ATM蛋白表達水平差異與細胞放射敏感性程度之間存在一定的關系 。江繼平等［8］用脂質體將反義ATM導入頭頸鱗癌細胞系(SCCⅦ)中，轉染24 h后ATM蛋白表達量減少，與轉入無關序列相比，轉染反義ATM的SCCⅦ細胞在輻照后表現(xiàn)出內在放射敏感性增強。實驗中我們用反義ATM使喉鱗狀細胞癌細胞中ATM mRNA、蛋白的表達降低，故我們推測其亦有可能使喉鱗狀細胞癌細胞對放射治療的敏感性增強。

［1］Lei L，Michael S，Randy JL.Cellular responses to ionizing radiation damage［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，49(4):1157 －1162

［2］Bartkova J，Horejsí Z，Koed K，et al.DNA damage response as acandidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis［J］.Nature，2005，434(7035):864 －870

［3］Gorgoulis VG，Vassiliou LV，Karakaidos P，et al.Activation of the DNA damagecheckpoint and genomic instability in human precancerous lesions［J］.Nature，2005，434(7035):907 －913

［4］Bartkova J，Bakkenist CJ，Rajpert D，et al.ATM activation in normal human tissues andtesticular cancer［J］.Cell Cycle，2005，4(6):838－845

［5］Pusapati VR，Robert J.ATM promotes apoptosis and suppressestumorigenesis in response to Myc［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(5):1446 －1451

［6］Haidar AM，Kantarjian H，Manshouri T，et al.ATM genedeletion in patients with adult acute lymphoblastic leukemia［J］.CANCER，2000，88(5):1057 －1062

［7］Zou J，Qiao XM，Ye HP，et al.Antisense inhibition of ATM gene enhances the radiosensitivity of head and neck squamous cell carcinoma in mice［J］.Journal of Experimental＆ Clinical Cancer Research，2008，27:56

［8］江繼平，馮 俊，唐嗣泉，等.反義ATM在體外對喉鱗狀細胞癌ATM蛋白表達影響的研究［J］.川北醫(yī)學院學報，2011，26(5):394－396