郭 準，周琳娜，李博生

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所，北京 100083）

螺旋藻[1-2]是存在于地球已逾30億a的低等水生藻類植物。它不僅可作為人類豐富的蛋白質(zhì)來源，其中某些蛋白質(zhì)和多肽還是重要的生理活性物質(zhì)，能促進免疫系統(tǒng)功能，抗氧化，降血壓，延緩衰老，抵抗多種疾病。大多數(shù)的強抗氧化肽和降壓肽主要集中在分子量在5 000 D以下的小肽[3]。通常采用酶解法[4]得到多肽初提物后，為了進一步得到分子量5 000 D以下的多肽，通常需要對酶解液進行后續(xù)復(fù)雜的分離純化。采用何種分離純化方法主要取決于所提取組分物質(zhì)和目的。目前主要有毛細管電泳法、反向高壓液相色譜法、超濾法和凝膠過濾層析法等[5]，試驗過程十分繁瑣、復(fù)雜。泡沫分離是膜分離技術(shù)的一種，它是以泡沫作為分離介質(zhì)，以組分之間的表面活性差異作為分離依據(jù)，利用在溶液中的鼓泡來達到富集物質(zhì)目的的一種新型分離技術(shù)[6]。該方法設(shè)備簡單，試驗過程簡潔，但目前采用泡沫分離法直接提取螺旋藻小分子多肽尚未見報道。筆者以螺旋藻為原料，采用泡沫分離法直接提取螺旋藻懸浮液上清液，并對提取液進行紫外可見光掃描和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜掃描，對泡沫分離提取液的主要成分進行了確定，研究了不同pH值和料液比對螺旋藻多肽溶解率、回收率以及提取率的影響以及最佳工藝參數(shù)。最后進行抗氧化活性實驗，對其總還原力以及對羥基自由基和超氧陰離子的清除能力進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 螺旋藻粉，北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所提供。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：FA1004電子天平（上海衡平儀器儀表廠）、HJ-3磁力攪拌機（金壇市金城金華儀器廠）、JKY/SJ-4A電子PH計（北京北瑞達醫(yī)藥科技有限公司）、TU-1901紫外分光光度計（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）、Thermo BIOFUGE PRTMO R centrifuge（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Thermo Heto Power Dry LL1500 Freeze Dryer（美國 Thermo Fisher Scientific公司）、4700 Proteomics Analyzer型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司）；試劑：所有試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 試驗裝置 圖1為泡沫分離的試驗裝置示意圖。泡沫分離柱的內(nèi)徑47 mm、高度700 mm?？諝饨?jīng)壓縮機壓縮后，通過氣體分布器，分散成氣泡由柱底通入螺旋藻藻懸液。泡沫沿柱體上升，到達柱頂后經(jīng)過泡沫溢出管進入泡沫收集裝置，每次試驗時間持續(xù)到產(chǎn)生的泡沫不能從裝置中溢出，停止通氣，每次收集的泡沫提取液采用攪拌方式消除泡沫。

圖1 試驗裝置結(jié)構(gòu)

1.2.2 螺旋藻泡沫提取物的制備 準確稱取0.5 g的螺旋藻粉于燒杯中，加入500 mL蒸餾水配置成料液比為1 g/L的螺旋藻藻懸液，調(diào)節(jié)pH值為9時，800 r/min磁力攪拌10 min。螺旋藻細胞內(nèi)物質(zhì)充分溶解后，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入圖1所示裝置進行泡沫提取并對提取液進行收集。將泡沫提取液冷凍干燥后得到粗提物。

1.2.3 紫外-可見光掃描 將粗提物加蒸餾水配置成1 mg/mL的溶液，利用TU-1901紫外分光光度計對其進行紫外-可見光掃描，初步分析提取液中所含物質(zhì)。掃描波段為200～850 nm。

1.2.4 基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜掃描將粗提物加蒸餾水配置成1 mg/mL的溶液，然后對其進行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS/MS）進行質(zhì)譜掃描，確定提取液中所含物質(zhì)及其分子量。

1.2.5 單因素試驗 分別考察不同料液比值（g/L）0.5、1、1.5、2，不同 pH 值 5、6、7、8、9，對泡沫分離法提取多肽的溶解率、回收率以及提取率的影響，確定最佳工藝參數(shù)。

1.2.6 多肽濃度的測定 采用福林酚試劑法，以牛血清白蛋白作標準曲線，在波長540 nm處測量上清液、消融后的泡沫提取液的多肽濃度[7]。

螺旋藻多肽溶解率P=（Ci×Vi）/m×100%；回收率W=（Cf×Vf）/（Ci×Vi）×100%；提取率Y=（P×W）×100%。

其中，Ci和Cf分別指上清液和提取液中多肽濃度（mg/mL），Vi和Vf分別指進樣原液和提取液的體積（mL），m 指藻粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.7 抗氧化活性試驗 （1）螺旋藻泡沫提取物總還原力的測定[8]：在2 mL樣品（空白用蒸餾水）中加入1%的鐵氰化鉀溶液2 mL以及濃度為0.2 mol/L的pH 6.6的磷酸鹽酸緩沖液2 mL，混合均勻后在50℃保溫20 min，然后加入10%的三氯乙酸2 mL，混合后3 000 r/min離心10 min。取上清液4 mL加入4 mL蒸餾水和0.1%的氯化鐵0.8 mL，混合均勻后在700 nm波長處測吸光值，記A700。以Vc作為對照。濃度設(shè)計 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10 mg/mL。吸光度A值越大，樣品還原能力越強。（2）螺旋藻泡沫提取物對超氧陰離子（O2）自由基清除能力的測定：采用鄰苯三酚自氧化法[9]，鄰苯三酚在弱堿條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生O2-，O2-清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在波長325 nm處吸收峰受到抑制。每支試管加入濃度為0.05 mol/L的Tris-HCL緩沖液4.5 mL（pH=8.2）、不同濃度樣品液1 mL、蒸餾水2.4 mL，搖勻后在25℃水浴保溫10 min。加入0.1 mL鄰苯三酚，搖勻，計時30 min，迅速加入0.1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，測325 nm處吸光度值 A325。以 Vc作為對照。濃度設(shè)計 0.5、1.0、2、0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。

清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中：A0為不加樣品溶液的吸光值；Ai為加入樣品溶液后的吸光值；Aj為不加鄰苯三酚的吸光值。

（3）螺旋藻泡沫提取物對羥基自由基清除能力的測定[10]：在10 mL試管中依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液2.0 mL，不同濃度的樣品液2.0 mL，6 mmol/L雙氧水溶液2.0 mL，搖勻后靜置10 min，在加入6 mmol/L的水楊酸溶液2.0 mL，搖勻后靜置30 min后于510 nm處測定其吸光度值A(chǔ)510。以Vc作為對照，濃度設(shè)計 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。

清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中：A0為不加樣品溶液的吸光值；Ai為加入樣品溶液后的吸光值；Aj為不加水楊酸溶液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡沫提取液的紫外可見光全波長掃描

將螺旋藻粗提取液凍干成粉末，并配置成1 mg/mL溶液后進行紫外全波長掃描。結(jié)果顯示：提取液在220 nm附近，有明顯的吸收峰（4.162 Abs），其峰高明顯大于提取液中其他物質(zhì)。小分子在小肽的分子結(jié)構(gòu)中200～220 nm處的吸收峰主要是由肽鍵產(chǎn)生的，270～290 nm范圍內(nèi)的吸收峰（0.874 Abs）主要是由芳香氨基酸側(cè)鏈的大π鍵產(chǎn)生的[11]。由此推斷溶液中可能含有大量多肽物質(zhì)。另外，在674 nm和620 nm附近也有一定的吸收峰（0.271 Abs，0.298 Abs），推測可能為別藻藍蛋白和藻藍蛋白[12]。

2.2 泡沫提取物基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜掃描

根據(jù)紫外-可見光全波長掃描，初步分析可知，螺旋藻粉泡沫提取液中多肽的含量比較高。為進一步確定提取液中所含物質(zhì)和分子量，進而對其進行質(zhì)譜分析，分析方法采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜掃描（MALDI-TOF-MS），結(jié)果如圖2所示，提取液中多肽分子量大多集中在5 000 D以下。另外，分子量在10 000 D和11 000 D左右有吸收波長，對比紫外全波長掃描結(jié)果，為藻藍蛋白和別藻藍蛋白。對質(zhì)譜掃描圖中2000～5000區(qū)域進行分析可知，取液中多肽的分子量主要為：2 230、2 278、2 358、2 484、2 556、2 612、2 845、2 953、2 994、3 017、3 034、3 301、3 541、3 748、3 775、3 884、4 261 D。分子量小于5 000 D的多肽大多具有抗氧化活性能力。

圖2 提取液的基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜掃描圖

2.3 料液比和pH值對螺旋藻多肽溶解率的影響

溶解率是指原液中多肽的質(zhì)量與藻粉質(zhì)量之比。由圖3可知，隨著料液比的增加，pH值的降低，螺旋藻多肽溶解率逐漸降低。當料液比為0.5 g/L時，pH值從5到9，多肽溶解率增加了2倍多。隨著料液比的增加，螺旋藻多肽的溶解率差距逐漸縮小，當料液比達到2 g/L時，不同pH值下溶解率非常接近。隨著料液比的增加，pH值對溶解率的影響越來越小。另外，越接近多肽的等電點，多肽的溶解率越低，pH=5更接近螺旋藻多肽的等電點[13]。

圖3 料液比和pH值對螺旋藻多肽溶解率的影響

2.4 料液比和pH值對螺旋藻多肽回收率的影響

回收率指提取液與原液中多肽質(zhì)量的百分比。由圖4可知，在相同pH值下，隨著料液比的增加，螺旋藻多肽回收率增加。當pH=9時，料液比從0.5 g/L增加到2 g/L，回收率從25%上升到92%，料液比對回收率影響顯著。當料液比大于1 g/L時，多肽回收率增加的速度減緩。隨著料液比的增加，pH值對回收率的影響越發(fā)顯著，在料液比0.5 g/L時，W（pH=9）與W（pH=7）相差4%，在料液比2 g/L時，W（pH=9）與W（pH=7）的差值增加至近30%。

2.5 料液比和pH值對螺旋藻多肽提取率的影響

圖4 料液比和pH值對螺旋藻多肽回收率的影響

提取率是指提取液螺旋藻多肽質(zhì)量與藻粉質(zhì)量的百分比。提取率的值等于回收率和溶解率的乘積。由圖5可知，在相同料液比下，提取率隨pH值的增加而提高；相同pH值下，提取率隨著料液比的增加先提高而后降低。在pH=9時，當料液比從0.5 g/L增加到1 g/L后，提取率提高了近2倍。在所選pH值和料液比范圍內(nèi)，當pH=9、料液比為1g/L時，螺旋藻多肽提取率達到最大值。綜合考慮溶解率、回收率和提取率3種因素，選取pH=9、料液比1 g/L為最佳工藝參數(shù)。

圖5 料液比和pH值對螺旋藻多肽提取率的影響

2.6 螺旋藻多肽的總還原力

由圖6可知，螺旋藻多肽提取物在濃度較低范圍內(nèi)，同Vc相比，還原能力較差。在測定范圍內(nèi)隨著濃度的增加吸光度值也增加，說明多肽提取物的還原能力具有較好的效量關(guān)系。Vc是較強還原劑，低濃度時還原能力已經(jīng)很強，隨著濃度增加吸光度值增加緩慢。在濃度為10 mg/mL時，多肽提取物的還原能力達到同濃度Vc的81.7%。

圖6 螺旋藻多肽、Vc的還原能力

2.7 螺旋藻多肽對超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是所有氧自由基中的第一個自由基，可經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他氧自由基，氧化能力很強，因此清除超氧陰離子具有特別重要的意義。由圖7可知，多肽提取物對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子有一定清除作用，隨著濃度增加多肽提取物對超氧陰離子的清除率上升，劑量關(guān)系明顯。當多肽提取物濃度為6 mg/mL時，對超氧陰離子的清除率達到47.3%。而對于Vc來說，在測定濃度范圍內(nèi)，對超氧陰離子的清除率迅速增大達到100%，然后保持不變。

圖7 螺旋藻多肽、Vc對超氧陰離子的清除作用

2.8 螺旋藻多肽對羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基是生命活動代謝過程所產(chǎn)生的自由基中最強的氧化劑，比高錳酸鉀和重鉻酸鉀的氧化性還強，是氧氣的三電子還原產(chǎn)物，反應(yīng)性極強，只要一產(chǎn)生，就會和緩沖液發(fā)生反應(yīng)，幾乎可以和所有細胞成分發(fā)生反應(yīng)，對機體傷害極大。由圖8可知，隨著濃度增加，多肽提取物和Vc對羥自由基的清除率同時增大，多肽提取物的增率較Vc小一些。Vc在2 mg/mL時，清除率已達到100%，隨后保持不變。多肽提取物在較小濃度5 mg/mL時，對羥基自由基的清除率為87.93%。由此可見，多肽提取物對羥自由基的清除效果較好。

圖8 螺旋藻多肽、Vc對羥基自由基的清除作用

3 討論與結(jié)論

采用泡沫分離法提取螺旋藻多肽，對提取液進行紫外可見光掃描和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn)，多肽分子量主要集中在5 000 D以下。綜合考慮溶解率、回收率和提取率3種因素，選取pH=9、料液比1 g/L為最佳工藝參數(shù)。對提取物進行抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，提取物有一定抗氧化能力且與濃度呈劑量關(guān)系。提取物的還原能力和超氧陰離子清除能力與Vc相比較低，可能因為其成分復(fù)雜且未純化有關(guān)。但其對羥自由基的清除能力，在較低濃度5 mg/mL時，達到了相同濃度Vc的87.93%，具有較好的清除率。

泡沫分離法與常用的酶解法提取多肽相比，前者得到的多肽分子量大多在5 000 D以下，且具有較強的抗氧化能力。后者為了得到分子量5 000 D以下的抗氧化多肽需要對其進行更加復(fù)雜的分離純化，選用超濾過膜或凝膠層析[14-15]。兩者提取率相差不大[16]，泡沫分離法實驗設(shè)備簡單，方法簡潔、環(huán)保，通常只需30～40 min，耗時較短。而酶解法通常需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，種類繁多的化學(xué)試劑，繁瑣的蛋白提取步驟，耗時較長[17]。對于泡沫分離法提取的小分子多肽，具有較強的抗氧化活性，是一種天然的抗氧化劑，可應(yīng)用在保健品和食品與飼料添加劑等方面。另外，抗氧化活性通常還與抑菌活性相關(guān)[18]，還可以對其進行更廣泛的研究。

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