徐 曉 歐陽(yáng)斌燊 歐陽(yáng)衛(wèi)澤

(九江學(xué)院附屬醫(yī)院 江西九江 332000)

目前胃癌治療方案的采用取決于TNM分期體系。TNM分期取決于腫瘤浸潤(rùn)的深度，淋巴結(jié)受累的數(shù)目和是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。處于相同分期的不同病人，預(yù)后表現(xiàn)不同。因此，有必要尋求一些與預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物和新的靶向治療位點(diǎn)。目前認(rèn)為不同的腫瘤惡性表型與其諸多基因改變和多種生物標(biāo)志物的表達(dá)差異密切相關(guān)。因此，聯(lián)合檢測(cè)生物標(biāo)記物的方法有望能夠更為準(zhǔn)確地評(píng)估胃腺癌患者的預(yù)后。

1 材料和方法

1.1 病例選擇

收集2002年2月～2003年10月間江西省人民醫(yī)院和九江學(xué)院附屬醫(yī)院胃腺癌手術(shù)切除標(biāo)本140例，隨訪到生存資料可作回顧性分析的有68例，隨訪時(shí)間1～60個(gè)月。140例胃腺癌術(shù)前均未經(jīng)放療和化療，術(shù)前或術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)并重新評(píng)估為胃腺癌。標(biāo)本均經(jīng)10%的福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋和蘇木精－伊紅 (HE)染色。胃腺癌組織學(xué)類(lèi)型和分化程度按照2002年世界衛(wèi)生組織 (WHO)提出的標(biāo)準(zhǔn)［1］;年齡、性別、腫瘤大小 (測(cè)量腫瘤最大直徑)、Laurén＇s分類(lèi)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移依據(jù)文獻(xiàn)所述［1－2］;切緣累及是鏡下切緣可見(jiàn)胃腺癌細(xì)胞浸潤(rùn);TNM分期依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì) (AJCC)提出的標(biāo)準(zhǔn)［3］。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用EnVision二步法，高溫高壓熱修復(fù)抗原，二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色。CDX2、VEGF、CD44、EGFR、pRb及所用二抗和DAB均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，采用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.3 染色結(jié)果判定［4］

染色結(jié)果判定采用半定量方法，通過(guò)評(píng)估染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性率來(lái)評(píng)分。目標(biāo)細(xì)胞:胃腺癌組織中的癌細(xì)胞。陽(yáng)性信號(hào):CDX2、pRb染色定位于細(xì)胞核，EGFR、CD44染色定位于細(xì)胞膜，VEGF染色定位于細(xì)胞質(zhì)。染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。細(xì)胞陽(yáng)性率計(jì)算隨機(jī)抽取5個(gè)高倍 (40×10)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野全部胃癌細(xì)胞及其著色的陽(yáng)性細(xì)胞，然后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。細(xì)胞陽(yáng)性率分為0、＜5%、5～50%、＞50%，分別評(píng)0分、1分、2分、3分。染色結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性率分?jǐn)?shù)相加所得積分，分成0和2分陰性(－)、3～4分陽(yáng)性 (+)和5～6分強(qiáng)陽(yáng)性 (++)3個(gè)等級(jí)。其中陰性組積分0和2分，陽(yáng)性組積分3～6分。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0進(jìn)行處理，以p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床病理特征和免疫組化數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)分析。生存分析單因素分析用Kaplan－Meier法和Log－Rank檢驗(yàn)計(jì)算并比較腫瘤相關(guān)蛋白和臨床病理特征與68例胃腺癌患者術(shù)后生存期之間的關(guān)系;多因素分析用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型和逐步前進(jìn)法分析腫瘤相關(guān)蛋白、臨床病理特征與患者術(shù)后生存期的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌中CDX2、VEGF、CD44、EGFR、pRb的表達(dá)及與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

140例胃腺癌手術(shù)標(biāo)本中，CDX2陽(yáng)性40例(28.6%)，EGFR陽(yáng)性45例 (32.1%)，pRb陽(yáng)性44例 (31.4%)，VEGF陽(yáng)性62例 (44.3%)，CD44陽(yáng)性53例 (37.9%)，5種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)如圖1－5。CDX2的表達(dá)與 Laurén＇s分型有關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)率在腸型胃癌中明顯高于彌漫型胃癌(χ2=5.657，p=0.017);VEGF的表達(dá)與年齡、Laurén＇s分型有關(guān)，在年齡≥50歲的病例中表達(dá)率高于年齡 ＜50歲組 (χ2=5.422，p=0.020);在腸型胃癌的表達(dá)率明顯高于彌漫型胃癌 (χ2=4.421，p=0.035);CD44的表達(dá)與切緣累及有關(guān)，在切緣累及的胃癌組表達(dá)率明顯高于無(wú)切緣累及組 (χ2=4.729，p=0.042);EGFR的表達(dá)與TNM分期相關(guān)，在I/II期的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于III/IV期 (χ2=3.889，p=0.049);pRb的陽(yáng)性表達(dá)率在男性胃癌組明顯高于女性組 (χ2=6.609，p=0.010)(見(jiàn)表1)。

2.2 CDX2、VEGF、CD44、EGFR和pRb的表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響

隨訪患者68例，總的1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為 82.35%、67.65%、61.76%。log－rank檢驗(yàn)單因素分析年齡、分化程度、Laurén＇s分型、TNM 分期、VEGF、CD44 和EGFR是影響胃腺癌預(yù)后的因素。VEGF、CD44、EGFR陰性表達(dá)的胃腺癌組預(yù)后明顯好于陽(yáng)性表達(dá)組 (χ2值分別為7.42、15.72、16.96，p值均 ＜0.01)，生存率的比較見(jiàn)圖6～9。年齡＜50歲、高/中分化、腸型和TNM分期I/II期的胃腺癌組預(yù)后明顯好于年齡≥50歲、低分化、彌漫型和TNM分期III/IV期的胃腺癌組 (p值均＜0.05)。胃腺癌的術(shù)后生存率在CDX2、pRb陽(yáng)性表達(dá)組和陰性表達(dá)組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 多因素COX回歸分析

對(duì)于單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后因素進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果顯示EGFR、TNM分期、年齡、VEGF和分化程度為胃腺癌患者長(zhǎng)期生存的獨(dú)立影響因素。

2.4 TNM分期聯(lián)合EGFR、CD44和VEGF的生存分析

根據(jù)TNM分期和EGFR、CD44、VEGF的表達(dá)情況，將本組病例分為6組，A組，TNM分期Ⅲ/Ⅳ期且EGFR、CD44和VEGF均為陽(yáng)性表達(dá)的胃腺癌 (9例);B組，TNMⅢ/Ⅳ期且 EGFR、CD44和VEGF任意一種或兩種蛋白陽(yáng)性表達(dá) (14例);C組，TNM分期Ⅲ/Ⅳ期且三種蛋白都陰性表達(dá) (14例);D組，TNM分期Ⅰ/Ⅱ期且三種蛋白都陽(yáng)性表達(dá) (2例);E組，TNM分期Ⅰ/Ⅱ期且任意一種或兩種蛋白陽(yáng)性表達(dá) (18例);F組，TNM分期Ⅰ/Ⅱ期且3種蛋白都陰性表達(dá) (11例)。生存分析結(jié)果 (如圖9)表明TNMⅢ/Ⅳ期的胃腺癌病例中C組預(yù)后好于A組和B組 (均p＜0.01)。

3 討論

3.1 EGFR與預(yù)后

最近，由于靶向因子的開(kāi)發(fā)，EGFR基因在人類(lèi)各種惡性腫瘤的研究較為顯著。在非小細(xì)胞肺癌中，已有文獻(xiàn)很好的記載EGFR是不良預(yù)后因子［7－8］。EGFR表達(dá)的結(jié)直腸癌和食管腺癌患者預(yù)后也較差［9－10］。在非小細(xì)胞肺癌，EGFR過(guò)表達(dá)或大量EGFR基因拷貝數(shù)量的患者對(duì)EGFR靶向治療有好的反應(yīng)。在胃癌，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)的預(yù)后和預(yù)測(cè)作用仍然是有爭(zhēng)議的。EGFR在胃癌的陽(yáng)性表達(dá)率，報(bào)道不一［4－6］，可能的原因包括:不同醫(yī)院采集的標(biāo)本、標(biāo)本固定劑的不同、保存時(shí)間的差異、觀察者之間的偏差以及免疫組化計(jì)分體系的不同。

筆者采用免疫組化評(píng)估了140例胃腺癌中EGFR蛋白的表達(dá)情況，EGFR陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)在45例 (32.1%)胃腺癌患者。生存分析表明EGFR是胃腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，可能帶來(lái)的價(jià)值是一部分患者將對(duì)EGFR靶向治療敏感。

3.2 VEGF與預(yù)后

腫瘤的生長(zhǎng)需要新生血管的形成，這種血管生成無(wú)疑打破了細(xì)胞增殖和凋亡的平衡。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子超家族成員VEGF似乎在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移中起著重要的作用，為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，使腫瘤細(xì)胞與宿主血管相延續(xù)。一些研究證明VEGF的表達(dá)是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素［11－12］。本研究再次證實(shí)VEGF陽(yáng)性表達(dá)的胃腺癌患者預(yù)后較差，多因素分析VEGF是胃腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

3.3 CD44與預(yù)后

最近，Takaishi等研究認(rèn)為應(yīng)用細(xì)胞表面分子CD44可證實(shí)胃癌干細(xì)胞，CD44陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞表現(xiàn)出自我更新和分化的能力并產(chǎn)生CD44陰性的細(xì)胞，CD44陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)化療或放療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的耐受性增加［13］，提示CD44陽(yáng)性表達(dá)的胃癌預(yù)后較差。

Ghaffarzadehgan等研究報(bào)道CD44在胃腺癌的表達(dá)率達(dá)到65%，在腸型胃癌表達(dá)較彌漫型胃癌更常見(jiàn)，CD44的表達(dá)與腸型胃癌的預(yù)后有關(guān)［14］。本研究中 CD44陽(yáng)性表達(dá)的胃腺癌患者53例(37.9%)較之前的研究偏低，可能與收集的病例中腸型胃癌所占的比例偏低以及免疫組化計(jì)分體系不同有關(guān)。單因素生存分析CD44是影響胃癌預(yù)后的因素，CD44陽(yáng)性表達(dá)的胃腺癌較CD44陰性表達(dá)的胃腺癌預(yù)后患者差，但多因素分析還不能認(rèn)為CD44是獨(dú)立預(yù)后因素。

3.4 CDX2、pRb與預(yù)后

Park等研究發(fā)現(xiàn)CDX2表達(dá)與腸型胃腺癌的浸潤(rùn)深度密切相關(guān)［15］，然而CDX2對(duì)于胃腺癌預(yù)后的影響研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)CDX2的表達(dá)與Laurén＇s分型有關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)率在腸型胃癌中明顯高于彌漫型胃癌，生存分析不能證明CDX2與胃腺癌預(yù)后有關(guān)。

pRb是進(jìn)入細(xì)胞周期的主要調(diào)控因子，控制G1－S期。Feakins等研究認(rèn)為pRb表達(dá)的下降與胃腺癌不良預(yù)后相關(guān)［16］。本研究結(jié)果并無(wú)發(fā)現(xiàn)pRb與胃腺癌預(yù)后相關(guān)，可能的原因是免疫組化計(jì)分體系的不同，因此標(biāo)準(zhǔn)化的免疫組化評(píng)分系統(tǒng)是預(yù)后評(píng)估的關(guān)鍵。

3.5 EGFR、CD44、VEGF聯(lián)合TNM分期對(duì)胃腺癌預(yù)后的影響

對(duì)單因素分析有預(yù)后意義的生物標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)，將具有回訪資料的68例胃腺癌分為A組:EGFR、CD44和VEGF三者都陽(yáng)性;B組:EGFR、CD44和VEGF三者中任意一種或兩種表達(dá);C組:EGFR、CD44和VEGF三者都陰性表達(dá)。研究表明三組生存率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中C組的預(yù)后最好，A組的預(yù)后最差。同一TNM分期如TNMⅢ/Ⅳ期的胃腺癌病例，EGFR、CD44和VEGF三者都陰性表達(dá)的病例預(yù)后好于三者都陽(yáng)性表達(dá)和其中任意一種或兩種表達(dá)的病例。因此，EGFR、CD44和VEGF聯(lián)合檢測(cè)能夠較好的區(qū)分處于不同疾病風(fēng)險(xiǎn)的TNMⅢ/Ⅳ期胃腺癌病例，為個(gè)體化治療提供了依據(jù)。

表1 胃腺癌CDX2、VEGF、CD44、EGFR、pRb的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 胃中分化腺癌，CD44在腫瘤細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá) (En-Vision法 ×400)

圖2 胃低分化腺癌，EGFR在腫瘤細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá) (En-Vision法 ×400)

圖3 胃中分化腺癌，pRb在腫瘤細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá) (EnVision法 ×400)

圖4 胃中分化腺癌，VEGF在腫瘤細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá) (En-Vision法 ×400)

圖5 胃低分化腺癌，CDX2在腫瘤細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá) (En-Vision法 ×400)

圖6 EGFR陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)組的生存曲線比較

圖8 VEGF陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)組的生存曲線比較

圖9 TNM分期結(jié)合EGFR、CD44、VEGF陽(yáng)性或陰性表達(dá)組的生存曲線比較

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