顏瑞巧 江洪濤 李衛(wèi)東

(1.九江學(xué)院附屬醫(yī)院;2.江西省系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西九江 332000))

在人抗兔多克隆抗體生產(chǎn)性制備中，兔的選擇是極其重要的環(huán)節(jié)。隨著普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖費(fèi)用不斷攀升及供求矛盾的日益突出，在保證人抗兔多克隆抗體質(zhì)量和數(shù)量的前提下，為了節(jié)省有限的普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔資源，同時(shí)降低生產(chǎn)成本，選擇家兔作為誘發(fā)載體的可行性研究具有實(shí)際意義。目前針對(duì)這個(gè)問(wèn)題的研究文獻(xiàn)較少，本研究利用合成多肽采取同樣條件對(duì)普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔和家兔進(jìn)行免疫，對(duì)獲得的相應(yīng)抗體質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行對(duì)比研究，探討家兔作為誘發(fā)載體的可行性。

1 材料和方法

1.1 用兔和分組

動(dòng)物分成兩組U組 (普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔)，T組(家兔)，每組30只，U、T均采用同樣的飼養(yǎng)方式和免疫方式。U組由南昌龍平兔業(yè)有限公司(生產(chǎn)許可證:SCXK(贛)2009－0001)提供普通級(jí)日本大耳兔雌雄各半，T組由市郊農(nóng)戶提供雌雄各半日本大耳兔。

免疫前檢驗(yàn)主要包括皮毛 (尤其是腹部)、體重、外觀、品系及免疫記錄等一般狀態(tài)，入檢疫區(qū)飼養(yǎng)1周，檢疫合格后每只兔耳靜脈采血2mL，用Westen－blot檢測(cè)血中已有抗體的狀態(tài)，檢測(cè)顯示普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔與家兔血清背景狀態(tài)并無(wú)差異，淘汰比率相同，見(jiàn)圖1。

圖1 部分兔血清Westen－Blot結(jié)果，左側(cè)為T(mén)組T1－4、T2－3、T3－2不合格;右側(cè)為U組U1－2、U2－2、U2－3不合格

1.2 免疫材料和方法

1.2.1 抗原 采用化學(xué)交聯(lián)的方法［1］將60種合成的多肽分別交聯(lián)到匙孔槭血藍(lán)蛋白 (keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，經(jīng)交聯(lián)的多肽作為抗原物質(zhì)。

1.2.2 佐劑、乳化和免疫方法 首次免疫D的方法:弗氏完全佐劑0.4mL與1mg/mL的抗原0.3mL混合上自動(dòng)乳化機(jī) (自制)乳化2h，檢查乳化效果，兔腹部皮下多點(diǎn) (20點(diǎn))注射。首免后第21d進(jìn)行二次免疫，方法:弗氏不完全佐劑0.35mL與1mg/mL的抗原0.25mL混合上自動(dòng)乳化機(jī)乳化2h，檢查乳化效果，兔腹部皮下多點(diǎn)(20點(diǎn))注射。二免后第21d實(shí)施三次免疫，方法同二免。

2 結(jié)果和分析 兩組三免后血清量及效價(jià)比較情況見(jiàn)表1。

表1 兩組三免后血清量及效價(jià)比較

由表1可知:①普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔和家兔血清背景檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＞0.05)。②兩種兔三免后抗體效價(jià)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＞0.05)。③兩種兔單位體重誘發(fā)抗體凍干物重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＞0.05)。

3 討論

選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮以下原則:近似性原則，差異性原則，易化原則，相容和匹配原則，可獲性原則，重復(fù)性和均一性原則［2］。在免疫學(xué)研究中選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)需特別注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳背景、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡，因不同種屬和品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)有很大的差異，年齡影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫機(jī)能［3］。在大量生產(chǎn)性制備多克隆抗體中更加注重可獲得性原則、兔齡、體重和皮毛的健康狀態(tài)。

家兔在免疫學(xué)研究領(lǐng)域常用來(lái)生產(chǎn)抗體、制備高效價(jià)和特異性強(qiáng)的免疫血清，其制品廣泛地應(yīng)用于人、畜各類抗血清和診斷血清的研制，如病原體血清，間接免疫血清、抗補(bǔ)體抗體血清和抗組織免疫血清等。家兔有特殊的血清型和唾液型，根據(jù)血細(xì)胞型凝集素的有無(wú)，兔可分為4個(gè)血清型，即 α＇、β＇、α＇β＇、O 型，兔的 α＇、α＇β＇血清型易產(chǎn)生人血細(xì)胞A型抗體，而β＇、O血清型易產(chǎn)生人血細(xì)胞B型抗體;兔的唾液己確認(rèn)有兩型，即易獲得人血細(xì)胞A型物質(zhì)者，稱排出型，不易獲得人血細(xì)胞A型物質(zhì)者，稱非排出型。唾液中有無(wú)A型物質(zhì)與A型抗體產(chǎn)生能力有密切關(guān)系，欲使之產(chǎn)生A型抗體，應(yīng)選用非排出型中的α＇、α＇β＇血清型兔［4］。

多克隆抗體的質(zhì)量主要決定于抗原的設(shè)計(jì)和后期純化，但免疫過(guò)程將直接影響抗體質(zhì)量和數(shù)量。在免疫前兔血清本底是否清晰會(huì)增加純化的難度，在免疫前兔血中已經(jīng)產(chǎn)生與所誘發(fā)抗體非常接近的抗體，這將直接影響純化過(guò)程，使目標(biāo)抗體產(chǎn)量和質(zhì)量均受到一定程度的影響。但隨著生產(chǎn)級(jí)別的純化工藝和技術(shù)不斷改善，在混雜的粗提物中純化目標(biāo)抗體的純化技術(shù)越來(lái)越成熟，對(duì)誘發(fā)抗體的動(dòng)物要求相對(duì)降低。本研究中結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因可能是普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并不完全針對(duì)生產(chǎn)性誘發(fā)抗體用兔。生產(chǎn)性抗體誘發(fā)主要關(guān)注兔血清中已經(jīng)產(chǎn)生抗體的數(shù)量和種類，這對(duì)抗體的后期純化帶來(lái)一定的影響。本次使用的普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔，在生產(chǎn)時(shí)各種原因造成兔質(zhì)量下降，這也可能成為結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因。

理論上采用清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)兔用于抗體制備肯定優(yōu)于其它級(jí)別的兔，在少量制備研究用珍貴抗體還是值得選擇清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)用兔，在大量生產(chǎn)性制備兔多克隆抗體的過(guò)程中全部選用清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)兔顯然不實(shí)際，選擇普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔也難以滿足生產(chǎn)需要，選用規(guī)范養(yǎng)殖的家兔制備大量兔多克隆抗體是比較實(shí)際的辦法，也是一個(gè)值得探討的內(nèi)容。

［1］(美)奧斯伯·艾主編，金由章艾譯校．精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南 ［M］．北京:科學(xué)出版社，2001.437．

［2］苗明三．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù) ［M］．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2002.489．

［3］施正良，劉之理．生物醫(yī)學(xué)中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與應(yīng)用 ［J］．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1994，6(2):20.

［4］牛澤清，趙勇．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在免疫學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用 ［J］．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2005，22(3):43．