羅元一 殷 明 殷嫦嫦

(1南昌大學第二附屬醫(yī)院 江西南昌 330006;2九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院 江西九江 332000)

椎間盤退變是臨床上引起腰腿痛的常見原因，至今其發(fā)生的具體機制尚不十分清楚［1］。目前研究表明髓核內(nèi)蛋白多糖含量的減少是椎間盤退變的共同特征，即蛋白多糖合成與分解的平衡失調(diào)可能是引起椎間盤退變的關(guān)鍵病理生理改變［2］。髓核細胞 (Nucleus pulposus cells，NPCs)對維持正常椎間盤內(nèi)環(huán)境以及修復退變的椎間盤有非常重要的作用［3］。對髓核細胞結(jié)構(gòu)、功能、代謝以及增值凋亡的研究有利于闡明椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展的具體機制。本實驗采用序貫酶消化法分離培養(yǎng)NPCs，并觀察細胞的黏附、增殖及形態(tài)改變，旨在建立一種成熟、有效的NPCs體外培養(yǎng)體系，為后續(xù)研究椎間盤退變的機制提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的250g左右大小SD大鼠3只，雌雄不限，由南昌大學動物科學部提供。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

DMSO、0.25%胰蛋白酶 (含 EDTA)、MTT粉劑、PBS粉劑，DMEM(含雙抗)，胎牛血清(Solarbio公司)，96孔板 (CORNING公司)，倒置相差顯微鏡及拍照系統(tǒng) (NIKON公司)，37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海蘇坤實業(yè)有限公司)，酶標儀 (Model680)(BIO－RAD公司)，CO2恒溫孵育箱 (SIM公司)，超凈工作臺 (蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 NPCs分離培養(yǎng) 將健康的250g左右大小SD大鼠3只采用頸椎脫臼法處死，75%酒精浸泡5～10min，轉(zhuǎn)入超凈臺內(nèi)，在無菌條件下取下大鼠胸腰段脊柱，徹底清除脊柱周圍肌肉組織，暴露脊柱之間的椎間盤組織，用小尖刀小心劃開纖維環(huán)，取出白色膠凍樣髓核組織，PBS液反復漂洗，洗去污物及血漬，將髓核組織用眼科剪剪成約1mm3的小碎塊，移入離心管中，0.25%胰蛋白酶在37℃恒溫振蕩器中振蕩消化30min，1000rpm離心5min，棄消化液，用PBS液漂洗2次，每次1000rpm離心5min，棄離心液，2mg/mLⅡ型膠原酶重懸離心碎塊組織后在37℃恒溫振蕩器中振蕩消化2h，每15min搖動1次，1000rpm離心5min，棄消化液，用PBS液漂洗2次，每次1000rpm離心5min，棄離心液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基7mL吹打重懸成細胞懸液，接種于100mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后首次半量更換培養(yǎng)基，去除漂浮在培養(yǎng)基中的組織塊，以后每3d換液1次，第12d左右傳代。

1.3.2 NPCs傳代培養(yǎng)及純化 倒置相差顯微鏡下觀察細胞，當細胞鋪滿瓶底接近80～90%時進行傳代。棄培養(yǎng)基后，用PBS漂洗2遍。0.25%胰酶液1.5mL消化貼壁細胞，鏡下見貼壁細胞變圓且有小部分細胞開始脫落時加入同等量含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化。5mL移液管反復吹打后，移至無菌離心管中。以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清夜，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基6mL重懸細胞，按1:3傳代，倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞在換液和傳代過程中逐漸純化。

1.3.3 MTT法繪制P3代NPCs生長曲線 取傳代培養(yǎng)的P3代細胞用0.25%胰酶消化，收集液體于離心管中，以1 000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基5mL重懸成單細胞懸液。細胞計數(shù)板上細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度約為1×104/mL，用加樣器移入96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)空白孔對照，每 3d換液次，分別于 24h、4d、7d、10d、13d、16d各取一塊96孔培養(yǎng)板每孔加入MTT溶液 (5mg/mL)20μL，再培養(yǎng)4h后，棄孔內(nèi)上清液，每孔加入 DMSO 150μL，搖勻振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標儀上選擇490nm波長檢測各孔吸光值，記錄結(jié)果。以時間(d)為橫軸，吸光度 (A)為縱軸繪制細胞生長曲線。［4］

1.3.4 細胞觀察 倒置相差顯微鏡在100倍視野下觀察NPCs的貼壁黏附、增殖及形態(tài)學變化。

1.3.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)由SPSS 18.0軟件統(tǒng)計處理，結(jié)果以平均值±標準差 (±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察結(jié)果

原代培養(yǎng)第3d半量換液后見少量貼壁細胞，部分呈多邊形，部分呈長梭形，周圍散在少量圓形細胞 (圖1A)，貼壁細胞輪廓清晰，細胞增殖較慢，細胞形態(tài)并不完全一致;第6d細胞呈典型的三角形、多角形、多邊形 (圖1B);第10d細胞呈漩渦狀、島狀、集落樣生長，細胞存在少量間隙，(圖1C);第12d細胞間緊密排列，鋪滿瓶底達80～90%(圖1D)。傳第1代細胞在90min后開始貼壁，8h后完成貼壁，與原代細胞相比長梭形細胞數(shù)量明顯減少，生長較均勻，不規(guī)則三角形、多角形、四邊形、多邊形細胞數(shù)量明顯增多，經(jīng)5～6d生長靜止期后呈出現(xiàn)呈對數(shù)增長趨勢，10d左右鋪滿瓶底達70～80%，12d左后鋪滿瓶底達80～90%，呈典型的多邊形、多角型生長，細胞形態(tài)較一致 (圖1E)。從傳3代以后細胞開始出現(xiàn)衰老、退變跡象，細胞貼壁時間緩慢約3h，細胞增殖速度較慢，鋪滿瓶底達80～90%約15d左右，細胞間隙增大，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顏色較深的顆粒，細胞碎片增多 (圖1F)。

圖1 細胞培養(yǎng)形態(tài)圖片

2.2 P3代細胞生長曲線

NPCs在接種后7d內(nèi)增殖相對緩慢，第7～13d生長曲線近似成線性曲線，表明這段時間細胞成對數(shù)生長，處于對數(shù)生長期，第13d后曲線逐漸變得平緩，細胞增殖速率明顯減慢，處于平臺期。

在酶標儀上選擇490nm波長檢測各孔吸光值，以時間 (d)為橫軸，吸光度 (A)為縱軸繪制P3代細胞生長曲線，見圖2。

圖2 P3代細胞生長曲線圖

3 討論

椎間盤退變引起的一系列脊柱退行性疾病及其繼發(fā)病變在臨床上十分常見，對于有癥狀的椎間盤退變患者原則上采取“階梯療法”，即依次按保守治療、經(jīng)皮治療、髓核摘除、髓核置換、椎間盤置換、脊柱融合術(shù)等進行治療［5］。近年來隨著組織工程的發(fā)展，使得利用髓核細胞作為種子細胞移植修復退變的椎間盤，甚至扭轉(zhuǎn)椎間盤退變成為可能［6］。已經(jīng)有臨床表明接受自體髓核移植的患者，可以緩解椎間盤退變引起的下腰背疼痛并能緩解椎間盤退變的程度［7，8］。因此，建立分離純化髓核細胞方法顯得尤為重要。

髓核細胞是一種類軟骨細胞，至今為止還沒有特異性的抗體來鑒定［9］，主要依靠觀察細胞形態(tài)，檢測II型膠原以及聚合蛋白［10］。本實驗采用體外序貫酶消化法分離培養(yǎng)NPCs，首先使用胰酶消化髓核組織能把髓核組織內(nèi)成團的細胞初步分散開，為后續(xù)使用II型膠原酶消化做好充足的準備，然后采用II型膠原酶消化可消化掉髓核細胞細胞外基質(zhì)中的II型膠原，而II型膠原是髓核細胞外基質(zhì)的主要成分［11］，從而更好的分離出髓核細胞。采用胰酶消化時，消化的時間不能過長，如時間過長會影響細胞活力，II型膠原酶消化時間可稍長，應(yīng)使膠原酶與髓核組織充分混勻、接觸。原代培養(yǎng)后的細胞經(jīng)過多次換液、傳代后得到形態(tài)比較一致的典型的多角形細胞，細胞呈漩渦狀、島狀、集落樣生長。與文獻報道的各種不同方法培養(yǎng)髓核細胞的形態(tài)基本一致，可初步判定為NPCs，P3代細胞生長曲線顯示細胞已經(jīng)開始出現(xiàn)衰老、退變，說明體外序貫酶消化法可獲得純度較高的NPCs，能保持細胞活力在P2代以前。采用該法培養(yǎng)髓核細胞能建立一種成熟、有效的NPCs體外培養(yǎng)體系，為后續(xù)研究椎間盤退變的機制提供細胞模型，同時也為組織工程應(yīng)用髓核細胞作為種子細胞修復退變的椎間盤提供了實驗室理論及技術(shù)保障。

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