陳櫻花 龔德華 劉正釗 章海濤 劉志紅 胡偉新

抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ANCA)相關(guān)血管炎(ANCA associated vasculitis，AAV)是由ANCA介導(dǎo)纖維素性小血管壁炎癥和壞死并導(dǎo)致多個(gè)器官組織損傷的系統(tǒng)性疾病。ANCA水平升高與AAV的活動(dòng)、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，清除循環(huán)中ANCA以控制血管炎活動(dòng)已成為臨床治療AAV的手段之一。既往我們采用葡萄球菌蛋白A免疫吸附(immunoadsorption，IA)清除ANCA及控制血管炎病變?nèi)〉昧肆己茂熜1]，但目前受到免疫吸附柱來(lái)源的限制，臨床無(wú)法常規(guī)開(kāi)展。雙重血漿置換(double filtration plasmapheresis，DFPP)是一種在血漿置換(plasma exchange，PE)基礎(chǔ)上改進(jìn)的選擇性血漿分離方法，采用血漿分離器(一級(jí)濾器)分離血漿后，再采用血漿成分分離器(二級(jí)濾器)濾過(guò)，分子量較小的血漿成分(主要為白蛋白及小分子蛋白)可被再次濾出返回患者體內(nèi)，從而相對(duì)選擇性的清除血漿中分子量較大的致病物質(zhì)(如致病性抗體、免疫復(fù)合物、冷球蛋白等)。我們的初步研究已顯示DFPP能有效降低血清IgG型ANCA[2]，有零星個(gè)案報(bào)道DFPP清除ANCA可改善AAV病情[3,4]，但因病例數(shù)量少，其療效難以評(píng)價(jià)。本文觀察了免疫抑制劑聯(lián)合DFPP對(duì)12例AAV的療效，觀察其清除血清ANCA的作用和對(duì)腎功能的影響。

對(duì)象和方法

病例選擇AAV符合Chapel Hill的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，血清ANCA陽(yáng)性，且均有腎臟受累或伴肺出血。腎活檢組織病理示寡免疫復(fù)合物節(jié)段壞死性新月體腎炎，可伴或不伴其他臟器(如肺、副鼻竇、皮膚和關(guān)節(jié)等)損害；排除繼發(fā)性血管炎，如過(guò)敏性紫癜、藥物過(guò)敏、狼瘡性血管炎和感染等。符合以下條件的AAV患者采用DFPP治療：(1)腎功能進(jìn)行性下降，SCr≥265.2 μmol/L，伴持續(xù)大量血尿，腎臟無(wú)縮??；腎外伴或不伴肺出血；(2)血清ANCA高滴度陽(yáng)性；(3)腎活檢病理示寡免疫復(fù)合物新月體腎炎或伴袢壞死、間質(zhì)血管炎。但除外活動(dòng)性感染、免疫缺陷、合并乙型或丙型病毒肝炎、伴嚴(yán)重心腦血管疾病的患者。

腎組織病理檢查所有患者均行腎活檢，腎組織進(jìn)行常規(guī)光鏡、免疫熒光和電鏡檢查。光鏡檢查腎組織經(jīng)石蠟包埋，切片厚度1.5 μm，常規(guī)行HE、PAS、PASM、Masson三色染色。免疫熒光采用冰凍切片，觀察腎組織IgG、IgA、IgM、C3、C1q的沉積強(qiáng)度及部位。參照文獻(xiàn)[6]，病理類(lèi)型分為新月體型(細(xì)胞性新月體≥50%)、混合型(細(xì)胞性新月體<50%，<50%腎小球硬化)、局灶型(≥50%腎小球正常)和硬化型(≥50%腎小球硬化)。腎小管間質(zhì)病變按累及范圍分為：+(<25%)，++(25%～50%)，+++(>50%)。

治療方案

DFPP方法[2]均采用右側(cè)頸內(nèi)靜脈留置雙腔導(dǎo)管作血管通路。DFPP采用血液凈化裝置IQ21(Asahi Kasei Kuraray Medical CO，Ltd，日本)，血漿分離器EC50W作一級(jí)濾器，血漿成分分離器EC20W作二級(jí)濾器。枸櫞酸聯(lián)合低分子肝素抗凝，使活化凝血時(shí)間延長(zhǎng)1倍以上。體外循環(huán)下全血以120～150 ml/min的速度流經(jīng)一級(jí)濾器，濾出的血漿以30～40 ml/min的速度進(jìn)入二級(jí)濾器再次濾過(guò)，濾出血漿回輸體內(nèi)，被截留的血漿成分滯留在二級(jí)濾器中不斷再循環(huán)，再循環(huán)流量60 ml/min。當(dāng)二級(jí)濾器前壓力逐步升高，超過(guò)150～160 mmHg時(shí)，停止分離血漿，用生理鹽水800 ml沖二級(jí)濾器，使二級(jí)濾器中滯留血漿成分進(jìn)一步濾過(guò)，并丟棄二級(jí)濾器中仍殘留的血漿成分。每次處理血漿量為2倍血漿容量，每次補(bǔ)充白蛋白30～40g，隔日治療1次，至少進(jìn)行3次。

免疫抑制劑 DFPP治療同時(shí)均給予甲潑尼松(MP)靜脈治療(0.5 g/d，3～6d)，后口服潑尼松[起始劑量為0.6 mg/(kg·d)]，4周后逐漸減量至10 mg/d維持。DFPP治療結(jié)束后給予嗎替麥考酚酯(MMF)1 g/d或間斷環(huán)磷酰胺(CTX)靜脈沖擊(NIH方案)誘導(dǎo)治療。

臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 觀察DFPP治療前后血清ANCA水平和腎功能變化。采用伯明翰血管炎活動(dòng)性評(píng)分(BVAS)評(píng)估AAV活動(dòng)性；腎損害指標(biāo)包括尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)、血清白蛋白，均參照既往報(bào)道的方法[7]。采用間接免疫熒光檢測(cè)pANCA、cANCA，ELISA法檢測(cè)抗髓過(guò)氧化酶抗體(MPO-ANCA)、抗蛋白酶3抗體(PR3-ANCA))和免疫球蛋白，參照既往報(bào)道的方法，測(cè)定DFPP治療前的基礎(chǔ)值及每次DFPP治療后次日的值[2]。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)數(shù)量采用免疫磁珠分離方法檢測(cè)[8]，血漿血管性假血友病因子(vWF)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)和E選擇素(E-selectin)水平采用ELISA法檢測(cè)，均參照我科既往報(bào)道的方法[9]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)之間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況2010年12月～2011年12月間南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所住院的12例AAV采用DFPP治療的患者，其中男性7例，女性5例，發(fā)生腎臟損害的平均年齡60.9±9.8歲(43～72歲)，腎活檢時(shí)血管炎腎臟損害平均病程為12.0±37.8月，平均BVAS 14.7±3.2分，其中10例p/MPO-ANCA陽(yáng)性，2例c/PR3-ANCA陽(yáng)性，ANCA水平221.3～341.4 RU/ml (平均 274.9±33.9 RU/ml)(表1)。腎臟損害均表現(xiàn)為急進(jìn)性腎炎綜合征(RPGN)，均需要腎臟替代治療，平均SCr水平(549.9±197.1)μmol/L，平均尿蛋白(2.8±2.3)g/24h，尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(1 355±1 123)萬(wàn)/ml，其中肉眼血尿4例。腎活檢病理均表現(xiàn)為寡免疫復(fù)合物節(jié)段壞死性新月體腎炎，細(xì)胞性新月體比例(37.4土27.3)%，球性硬化比例(31.6土28.4)%。病理分型新月體型5例，混合型和硬化型各3例，局灶型1例。腎外損害包括鼻竇炎(6例)，肺出血(4例)，間質(zhì)性肺炎(1例)，關(guān)節(jié)炎(3例)和聽(tīng)力喪失(1例)。

表1 臨床及病理特征

臨床療效 DFPP治療3～5次(平均3.5次)。DFPP治療前后血清ANCA水平變化和對(duì)腎功能的影響見(jiàn)表2。4例伴肺出血的患者，1例癥狀輕，經(jīng)激素治療后即緩解；另3例經(jīng)DFPP治療后均緩解。

ANCA水平 DFPP治療結(jié)束時(shí)ANCA水平顯著下降[(274.9土33.9)RU/mlvs(111.8±55.1)RU/ml，P<0.01]，平均下降(60.0±18.1)%。其中 8例DFPP治療3次，ANCA平均下降(57.1±19.1)%，DFPP治療4次和5次的患者各2例，ANCA分別下降(78.8±13.1)%和(52.8±5.14)%(圖1)。隨訪1～15月，4例ANCA轉(zhuǎn)陰，6例ANCA水平穩(wěn)定，2例升高。

腎功能 DFPP治療結(jié)束后，10例(83.3%)擺脫透析，病理類(lèi)型分別為新月體型4例，混合型3例，硬化型2例和局灶型1例。1例新月體型僅隨訪1月尚未擺脫透析。1例硬化型腎功能無(wú)改善，轉(zhuǎn)為維持性腎臟替代治療。

1例維持性腎臟替代治療的患者給予小劑量激素，余2例激素聯(lián)合MMF，9例為激素聯(lián)合間斷靜脈CTX沖擊治療。擺脫透析的10例患者平均隨訪6.2土4.8月(1～15月)，1例(局灶型)腎功能恢復(fù)正常，8例(新月體型和混合型各3例，硬化型2例)Scr穩(wěn)定，1例(新月體型)1月后，MPO-ANCA水平伴SCr再次升高行腎臟替代治療。病例1、9、10隨訪9～15月，尿檢均明顯改善(表2)。

圖1 DEPP治療后ANCA的變化

表2 DFPP治療前后臨床療效比較

T淋巴細(xì)胞亞群 DFPP治療結(jié)束時(shí)CD4+淋巴細(xì)胞[(380.5±256.6)個(gè)/ulvs(279.2±241.9)個(gè)/ul，P>0.05]和CD8+淋巴細(xì)胞[(225.2±163.5)個(gè)/ulvs(295.1±315.7)個(gè)/ul，P>0.05]均無(wú)明顯變化。

血管內(nèi)皮損傷標(biāo)記物 觀察了9例DFPP治療前后循環(huán)內(nèi)皮損傷標(biāo)記物水平的變化發(fā)現(xiàn)，DFPP治療后CECs數(shù)量[(33土21)個(gè)/mlvs(28±13)個(gè)/ml，P>0.05]、VCAM-1[(1 395.8土559.4)ng/mlvs(1 197.5±341.9) ng/ml，P>0.05]、vWF[(198.2±59.2)%vs(194.2±8.9)%，P>0.05]和E-selectin[(80.9±36.5)ng/mlvs(52.8±15.1)ng/ml，P>0.05]均下降。

不良反應(yīng)DFPP治療過(guò)程中無(wú)過(guò)敏、感染、出血、血栓等不良反應(yīng)。隨訪期間，病例12間斷CTX沖擊治療3月時(shí)發(fā)生肺部感染，經(jīng)抗感染治愈。

討 論

DFPP治療AAV的臨床療效AAV患者的腎功能不全發(fā)生率高，本文12例患者均存在腎功能不全，并需腎臟替代治療。AAV中的微型多血管炎預(yù)后較差，3年腎存活率僅58.5 %[10]。AAV治療初期的腎功能狀態(tài)對(duì)預(yù)后有顯著影響[11]。現(xiàn)有治療AAV的免疫抑制劑方案，包括MP靜脈沖擊、聯(lián)合CTX或MMF，臨床緩解率可達(dá)80%～94%[12,13]，在一定程度上改善了患者預(yù)后。但在嚴(yán)重腎功能損害者療效差，治療初期需透析患者腎存活率仍很低，治療1年后擺脫透析者僅50%[11]。因此，還需新的治療手段改善AAV患者的預(yù)后。

ANCA是致病性抗體，具有直接損傷腎和肺毛細(xì)血管的作用，應(yīng)用PE[14]和IA[1]等體外循環(huán)方法可快速清除體內(nèi)ANCA，從而控制AAV活動(dòng)，促進(jìn)腎功能恢復(fù)。PE是采用一級(jí)血漿分離器，從全血中分離血漿并棄除，再補(bǔ)充等量正常新鮮血漿或白蛋白置換液，以清除血液中的致病因子。PE治療AAV的療效已經(jīng)得到了臨床研究的證實(shí)。Jayne等[14]的多中心前瞻性臨床對(duì)照研究觀察了137例SCr>500 μmol/l的AAV患者分別采用大劑量MP靜脈沖擊治療或MP聯(lián)合PE的療效發(fā)現(xiàn)，3月內(nèi)擺脫透析的比例PE組顯著高于MP沖擊治療組(69%vs49%，P=0.023),隨訪12月時(shí)PE組進(jìn)展至終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)下降24%。因此，對(duì)有嚴(yán)重腎功能不全的AAV推薦免疫抑制藥物聯(lián)合PE(KDIGO指南)。但是PE清除ANCA為非選擇性，在分離出的血漿中還丟失了大量人體必需物質(zhì)，如白蛋白、凝血因子，因此，每次PE需要補(bǔ)充大量的人體血漿或白蛋白等血制品。而輸注血制品存在病毒(肝炎病毒、HIV等)感染的風(fēng)險(xiǎn)。另一種清除血ANCA的方法是IA[1]。IA通過(guò)免疫吸附柱(如葡萄球菌A蛋白吸附柱)，選擇性吸附血液中的IgG型自身抗體抗體，具有選擇性強(qiáng)、保留有用血漿成分，避免疾病傳播特點(diǎn)，但因免疫吸附柱來(lái)源困難，限制了臨床應(yīng)用。

DFPP是在PE的基礎(chǔ)上，再引入第2個(gè)孔徑較小的濾器，分子量較大的物質(zhì)(免疫球蛋白、自身抗體、免疫復(fù)合物等)被截留，分子量較小的血漿成分(主要為白蛋白及小分子蛋白)被二級(jí)濾器濾出后回輸體內(nèi)。DFPP能相對(duì)高選擇性地清除血漿中分子質(zhì)量較大的致病物質(zhì)，減少了白蛋白和其他血漿成分的丟失，能減少血漿/白蛋白補(bǔ)充量。我們的初步研究顯示，采用EC50W/EC20W濾器組合方式對(duì)IgG型MPO-ANCA的清除具有較高的選擇性，能有效降低血清ANCA水平，避免其他大分子物質(zhì)的丟失[2]。

已有個(gè)案報(bào)道發(fā)現(xiàn)AAV經(jīng)DFPP治療后ANCA水平下降或轉(zhuǎn)陰，SCr下降[3,4]。有研究發(fā)現(xiàn)存活的12例AAV患者接受DFPP治療的比例為42%，死亡的7例中接受DFPP治療的僅14%，提示DFPP治療能改善AAV的預(yù)后[15]。本研究觀察發(fā)現(xiàn)DFPP治療能使ANCA水平顯著下降60%，80%以上的患者暫時(shí)擺脫腎臟替代治療。此研究表明DFPP能快速有效降低血清ANCA水平，從而控制AAV活動(dòng)性，改善腎功能。本文DFPP治療后ANCA水平較低的4例在隨訪中ANCA均轉(zhuǎn)陰，而病理類(lèi)型為新月體型的2例，分別經(jīng)DFPP治療5次和3次，ANCA仍高滴度陽(yáng)性，1例擺脫透析僅1月再次行腎臟替代治療，另1例隨訪1月尚未擺脫透析。關(guān)于DFPP治療的次數(shù)及劑量，ANCA下降的目標(biāo)值與AAV預(yù)后的關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外研究尚未明確，還需進(jìn)一步的研究。另外，本研究中伴肺出血的患者，經(jīng)DFPP治療后肺出血均緩解，表明DFPP能控制活動(dòng)性肺出血[16]，提高患者的存活率。但由于本研究為非對(duì)照研究，DFPP對(duì)AAV的治療效果，尤其對(duì)改善遠(yuǎn)期腎功能和減少血管炎復(fù)發(fā)的療效還需進(jìn)行對(duì)照研究和長(zhǎng)期隨訪。

DFPP改善腎功能和緩解肺出血的療效不僅與其有效清除ANCA相關(guān)，還可能與其改善血管內(nèi)皮功能有關(guān)[17]。本文檢測(cè)了DFPP治療前后循環(huán)內(nèi)皮損傷標(biāo)記物的變化，發(fā)現(xiàn)DFPP治療后CECs數(shù)量、VCAM-1、vWF和E-selectin水平均下降，表明內(nèi)皮損傷改善。但DFPP的治療機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

DFPP治療期間未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，僅1例在隨訪期間發(fā)生肺部感染，較PE和IA治療后報(bào)道的感染發(fā)生率低[1,14]，表明DFPP安全性較好。

DFPP對(duì)不同病理類(lèi)型的治療效果研究顯示腎組織病理改變可以預(yù)測(cè)AAV腎臟預(yù)后，正常腎小球的比例越高，提示近期和遠(yuǎn)期預(yù)后良好，硬化腎小球的比例越高，預(yù)后越差，細(xì)胞性新月體與腎功能的恢復(fù)相關(guān)，纖維性新月體提示遠(yuǎn)期腎預(yù)后差[18,19]。本研究4例(4/5)新月體型、3例混合型和1例局灶型經(jīng)DFPP治療后均擺脫腎臟替代治療。但硬化型3例中也有2例經(jīng)DFPP治療后擺脫了透析，表明不能僅根據(jù)腎小球硬化的比例來(lái)決定是否應(yīng)該積極治療，還要根據(jù)臨床綜合判斷腎臟病變的活動(dòng)性和可逆程度，以免錯(cuò)失治療時(shí)機(jī)。作者認(rèn)為AAV導(dǎo)致嚴(yán)重腎功能不全時(shí)，只要腎臟未萎縮，且伴有大量血尿，血清ANCA滴度較高，腎活檢病理上仍可見(jiàn)細(xì)胞或細(xì)胞纖維性新月體、袢壞死等活動(dòng)性病變時(shí)，均應(yīng)考慮聯(lián)合DFPP，積極改善腎功能。

小結(jié)：DFPP治療能有效清除AAV患者血清ANCA，改善腎功能，但其療效還需大樣本臨床對(duì)照研究的證實(shí)。

1 梅潔卉,胡偉新,季大璽,等.免疫吸附治療ANCA相關(guān)血管炎的初步觀察.腎臟病與透析腎移植雜志，2007,16(4):316-321.

2 龔德華,季大璽,朱冬冬,等.選擇性血漿分離器行雙重血漿置換對(duì)抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體清除的研究.腎臟病與透析腎移植雜志，2011,20(3):212-217.

3 Ito C,Ando Y,Akimoto T,et al.Comparison of plasma exchange(PEX) vs.double filtration plasmapheresis (DFPP) with or without steroid administration in a case of MPO-ANCA-positive immune complex type crescentic glomerulonephritis.Nippon Jinzo Gakkai Shi,2000,42(5):374-380.

4 Takeshita Y,Takagi N,Yamada A,et al.Diabetes mellitus associated with rapidly progressive glomerulonephritis with perinuclear antineutrophil cytoplasm antibodies.Intern Med,2000,39(2):154-156.

5 Jennette JC,Falk RJ,Andrassy K,et al.Nomenclature of systemic vasculitides:the proposal of an International Consensus Conference.Arthritis Rheum,1994,37(2):187-192.

6 Berden AE,Ferrario F,Hagen EC,et al.Histopathologic classification of ANCA-associated glomerulonephritis.J Am Soc Nephrol,2010,21(10):1628-1636.

7 胡偉新,陳惠萍,唐 政,等.霉酚酸酯與間斷環(huán)磷酰胺沖擊療法治療IV型狼瘡性腎炎的療效比較.腎臟病與透析腎移植雜志,2000,9(1):3-8.

8 Woywodt A,Streiber F,de Groot K,et al.Circulating endothelial cells as markers for ANCA-associated small-vessel vasculitis.Lancet,2003,361(9353):206-210.

9 張慶燕,曾彩虹,陳朝紅,等.局灶節(jié)段性腎小球硬化患者內(nèi)皮細(xì)胞功能異常及臨床意義.腎臟病與透析腎移植雜志，2010，19(4)：309-316.

10 胡偉新,劉春蓓,唐 政,等.微型多血管炎腎損害的預(yù)后.腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(5):419-430.

11 胡偉新,劉春蓓,謝紅浪,等.霉酚酸酯與環(huán)磷酰胺治療ANCA相關(guān)血管炎的臨床對(duì)照研究.腎臟病與透析腎移植雜志,2005,14 (6):501 - 507.

12 Jayne D,Rasmussen N,Andrassy K,et al.A randomized trial of maintenance therapy for vasculitis associated with antineutrophil cytoplasmic autoantibodies.N Engl J Med,2003,349(1):36-44.

13 Booth AD,Almond MK,Burns A,et al.Outcome of ANCA-associated renal vasculitis:a 5-year retrospective study.Am J Kidney Dis,2003,41(4):776-784.

14 Jayne DR,Gaskin G,Rasmussen N,et al.Randomized trial of plasma exchange or high-dosage methylprednisolone as adjunctive therapy for severe renal vasculitis.J Am Soc Nephrol,2007,18(7):2180-2188.

15 Yoshida A,Takeda A,Fukuda M,et al.Therapeutic effect and clinical findings in patients with MPO-ANCA associated vasculitis syndrome.Ryumachi,2000,40(1):1-8.

16 Iwatani H,Uzu T,Kakihara M,et al.A case of Wegener’s granulomatosis with pulmonary bleeding successfully treated with double filtration plasmapheresis(DFPP).Clin Exp Nephrol,2004,8(4):369-374.

17 Yokoyama H,Wada T,Zhang W,et al.Advances in apheresis therapy for glomerular diseases.Clin Exp Nephrol,2007,11(12):122-127.

18 de Lind van Wijngaarden RA,Hauer HA,Wolterbeek R,et al.Clinical and histologic determinants of renal outcome in ANCA-associated vasculitis:A prospective analysis of 100 patients with severe renal involvement.J Am Soc Nephrol,2006,17(8):2264-2274.

19 Hauer HA,Bajema IM,van Houwelingen HC,et al.Determinants of outcome in ANCA-associated glomerulonephritis:A prospective clinico-histopathological analysis of 96 patients.Kidney Int,2002,62(5):1732-1742.