郭 敏，閆 蕊，呂吉元，范春雨

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是在大、中動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞損傷后細(xì)胞免疫所接到的慢性炎癥反應(yīng)［1］。隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制及危險(xiǎn)因素的深入了解和積極控制，慢性心血管病的一級(jí)預(yù)防取得了令人鼓舞的進(jìn)展，然而急性心血管事件（包括心臟性猝死和急性冠狀動(dòng)脈綜合征）的預(yù)防及治療仍缺乏有效的措施。近年研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致急性心血管病事件的主要原因是AS斑塊的易損性，而炎癥在易損斑塊發(fā)生機(jī)制中的核心作用日益受到重視［2］。

MicroRNA是一組最近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性的非蛋白編碼調(diào)控RNA，這些含有19個(gè)～23個(gè)核苷酸單鏈RNA可以通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTRs不同程度的互補(bǔ)結(jié)合，以降解靶基因mRNA或抑制翻譯兩種方式調(diào)節(jié)生物體內(nèi)基因的表達(dá)［3］。晚近研究提示，MicroRNA（miR－146a）在T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞中均有表達(dá)，并與多種炎癥因子及轉(zhuǎn)錄因子的活性有密切關(guān)系，在免疫反應(yīng)中miR－146a可能發(fā)揮了精細(xì)的調(diào)控作用［4］。本研究通過(guò)對(duì)急性冠脈綜合征患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)miR－146a表達(dá)水平的檢測(cè)及其與炎癥因子相互關(guān)系的探討，為miR－146a在ACS中的基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2011年7月—2012年2月在我院住院及門(mén)診隨訪的患者91例，其中急性心肌梗死（AMI）26例，不穩(wěn)定型心絞痛（UA）25例，穩(wěn)定型心絞痛（SA）22例，胸痛綜合征（CPS）18例，所有患者均行冠狀動(dòng)脈造影檢查。CPS組為胸痛但不伴有心電圖改變和冠狀動(dòng)脈狹窄及痙攣［5］。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重的肝腎功能不全；心臟或其他部位的急、慢性炎癥；合并腦卒中；惡性腫瘤；風(fēng)濕性疾??；高熱以及應(yīng)用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇及鴉片類藥物等。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣采集 AMI與UA患者均在發(fā)病24h內(nèi)從前臂周圍靜脈采取空腹血標(biāo)本，SA組和CPS組于冠狀動(dòng)脈造影時(shí)采血3mL，肝素鈉抗凝。

1.2.2 Real－time PCR法檢測(cè) miR－146amRNA的表達(dá) 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用 miReasy Mini Kit試劑盒提?。?00bp RNA，每組設(shè)10μL RT反應(yīng)體系采用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取5μL cDNA模板采用the miScript Primer Assay及the miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR。miR－146a擴(kuò)增應(yīng)用 miScript通用引物及其特異性引物（5′－UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU－3′the miScript Primer Assay），同時(shí)以5S作為內(nèi)參（上述試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司，所用操作步驟均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Northern blot法驗(yàn)證miR－146amRNA表達(dá) 分別提取各組細(xì)胞總RNA各100μg，用8M尿素變性的15%聚丙烯酰胺凝膠分離，并用半干式轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至尼龍膜，紫外交聯(lián)固定。預(yù)雜交后，加入地高辛標(biāo)記的探針，42℃雜交24h。經(jīng)洗膜、曝光與放射自顯影后觀察，所用的寡核苷酸探針為miR－146a：U6：5′－CTCGCTTCGGCAGCAGCACA－3′。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基上清炎癥因子的表達(dá) 分離的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／mL，加入植物血凝素（PHA）5ng／mL濃度，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清儲(chǔ)存于－20℃用于細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子（TNF－α）、γ干擾素（IFN－γ）、白介素－10（IL－10）檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，行方差齊性檢驗(yàn)，多個(gè)均數(shù)比較用單因素方差分析，兩個(gè)均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組臨床資料比較（見(jiàn)表1） 4組患者的年齡、血脂均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 4組患者年齡、血脂比較（x±s）

2.2 Real－time PCR和Northern blot檢測(cè) miR－146amRNA結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2 各組miR－146amRNA檢測(cè)結(jié)果（x±s） %

2.3 PBMCs培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 與SA組及CPS組相比，AMI及UA組TNF－α、IFN－γ表達(dá)明顯升高（P＜0.01），IL－10則無(wú)顯著變化（P＞0.05）。SA組及CPS組間和AMI及UA組間各個(gè)細(xì)胞因子間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 PBMCs培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果（x±s）ng／mL

2.4 miR－146a與炎癥因子的相關(guān)性 miR－146a與TNF－α（r＝0.612，P＜0.01）、IFN－γ（r＝0.573，P＜0.01）呈顯著正相關(guān)，而與IL－10無(wú)顯著相關(guān)性（r＝0.166，P＞0.05）。

3 討 論

ACS是不穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊發(fā)生破裂繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成、血管痙攣而引起的一系列急性和亞急性心肌缺血的臨床綜合征。臨床表現(xiàn)為不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死。炎癥反應(yīng)在ACS不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生、發(fā)展及最終破裂過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此，參與ACS不穩(wěn)定斑塊破裂的炎癥因子及其調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)防治急性冠脈綜合征至關(guān)重要。

晚近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA是一種存在于各種生物體內(nèi)的具有廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、凋亡、分化和發(fā)育的微小RNA。到目前為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種MicroRNA，它們有可能對(duì)人類基因組中近30%的基因發(fā)揮調(diào)控作用［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，眾多miRNA和靶基因之間形成復(fù)雜的功能網(wǎng)絡(luò)，在免疫反應(yīng)強(qiáng)度、時(shí)效性、細(xì)胞分化和功能調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)均可發(fā)揮精細(xì)調(diào)節(jié)作用［7］。晚近研究發(fā)現(xiàn)，miR－146a在銀屑病皮損部位和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變部位的滑膜細(xì)胞。巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及B細(xì)胞中表達(dá)均增加，提示miR－146a參與了慢性炎癥的病理過(guò)程［7］。Taganov等［8］研究也發(fā)現(xiàn)在 LPS刺激后的單核細(xì)胞中miR－146a的表達(dá)增加，炎癥因子TNF－α、IL－1β也可以通過(guò)NF－κB依賴的途徑誘導(dǎo)miR－146a表達(dá)上調(diào)，從而提出miR－146a可能是免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。而以往大量研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及銀屑病都是Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)而導(dǎo)致的器官特異性自身免疫疾病，可能有類似的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)miR－146a在ACS患者中的表達(dá)較之CPS及SA患者中的表達(dá)明顯增高，提示miR－146a可能參與了ACS的斑塊炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致臨床心血管事件的發(fā)生。

TNF－α和IFN－γ是具有廣泛生物學(xué)特性的多肽調(diào)節(jié)因子，在介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要作用，二者在AS中大量表達(dá)，它們可以誘導(dǎo)自身表達(dá)及使其他細(xì)胞因子及黏附分子表達(dá)增加；損傷內(nèi)皮細(xì)胞，刺激血管平滑肌增殖和收縮，促進(jìn)AS斑塊形成和斑塊損傷處血管痙攣收縮；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡等，從而促進(jìn)了斑塊的破裂，導(dǎo)致了ACS的發(fā)生。IL－10被認(rèn)為是一種免疫抑制因子，可抑制單核巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞合成炎癥因子，減慢AS進(jìn)程，也有研究證明IL－10在外周血中有抑制組織因子的作用，從而在AS進(jìn)程中發(fā)揮抗炎、抗栓作用，起到穩(wěn)定斑塊，防治ACS發(fā)生的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在ACS患者PBMC培養(yǎng)上清中促炎因子TNF－α和IFN－γ明顯增高，抗炎因子IL－10變化不明顯，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR－146a的表達(dá)與TNF－α和IFN－γ呈明顯正相關(guān)，提示miR－146a可能是通過(guò)促進(jìn)致炎因子的表達(dá)，促進(jìn)ACS的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR－146a可能在ACS的免疫反應(yīng)中發(fā)揮積極的作用，從而可以成為ACS基因治療的新靶點(diǎn)，將在下一步的研究中通過(guò)體外干預(yù)miR－146a表達(dá)，進(jìn)一步探討其在免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為ACS的臨床防治提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

［1］ Libby P.Inflammation and cardiovascular disease mechannisms［J］.Am J Clin Nutr，2006，83（2）：456S－460S.

［2］ 張運(yùn).攻克易損斑塊 根除心臟事件［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84（13）：1057－1059.

［3］ Bartel DP.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116：281－297.

［4］ Taganov KD，Boldin MP，Baltimore D.MicroRNAs and immunity：Tiny players in a big field ［J］.Immunity，2007，26 （1）：133 －137.

［5］ Soejima H，Irie A，Miyamoto S，et al.Preference toward a T helper type 1response in patients with coronary spastic angina［J］.Circulation，2003，107：2196－2220.

［6］ Lewis BP，Burge CB，Barrel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets［J］.Cell，2005，120（1）：15－20.

［7］ Sonkoly E，Wei T，Janson PC，et al.MicroRNAs：Novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis［J］.PLoS ONE，2007，2（7）：e610.

［8］ Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF－kappaB dependent induction of microRNA miR－146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（33）：12481－12486.