關(guān)晴 ，阮長(zhǎng)青 ，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）

黃豆醬是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品之一，黃豆醬亦稱大豆醬，豆醬，是以大豆和面粉為主要原料，通過微生物發(fā)酵釀制而成的一種半流動(dòng)狀態(tài)的調(diào)味品[1]。大豆和面粉經(jīng)曲霉，酵母菌，乳酸菌等菌種產(chǎn)生的復(fù)合酶系分解，產(chǎn)生朊，胨，多肽，氨基酸，葡萄糖，果糖，乳酸，醋酸等物質(zhì)使黃豆醬具有較高的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味[2]。大豆發(fā)酵食品中的生理功能性物質(zhì)，可分為兩大類，一類是大豆原料中固有的，如大豆蛋白質(zhì)、消化酶、維生素、亞油酸、皂角甙、異黃酮、膽堿、胰蛋白酶抑制物等。另一類則是在發(fā)酵、加工過程中產(chǎn)生的，類黑精褐色色素、肽類等[3]。近年來，大豆發(fā)酵食品中的低聚肽因具有較高的生物活性而備受關(guān)注。Esaki等[4]報(bào)告了日本大豆發(fā)酵制品中存在抗氧化物質(zhì)。韓國(guó)黃豆醬中也相繼發(fā)現(xiàn)了ACE抑制肽[5]，呈鮮味的寡肽[6]。

經(jīng)水法提取的黃豆醬多肽溶液含鹽量較高，不利于后期肽的分離，應(yīng)予以去除。生物活性物質(zhì)脫鹽的方法有超濾、納濾、電滲析、樹脂吸附法等，但采用電滲析或超濾、納濾技術(shù)處理會(huì)造成一些低肽分子的損失，影響回收率[7-8]。大孔吸附樹脂和離子樹脂可根據(jù)分離物分子量大小及極性不同進(jìn)行分離，同時(shí)具有吸附、篩選的功能，其吸附特性與天然吸附劑特性相同[8-9]。張鵬采用陰陽(yáng)離子交換樹脂對(duì)大豆蛋白肽脫鹽后蛋白回收率為88.2%，脫鹽率為90.3%[10]。張宇昊等對(duì)花生短肽脫鹽工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示陰陽(yáng)離子混合床脫鹽法效果最優(yōu)[11]。試驗(yàn)對(duì)黃豆醬多肽溶液脫鹽過程中樹脂的選擇、脫鹽工藝條件進(jìn)行研究，旨在獲得最大的脫鹽率和肽回收率，為后期的肽的脫色、分離、生物活性評(píng)價(jià)、一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃豆醬，黑龍江省寶泉醬業(yè)有限公司；D311樹脂、201×7樹脂、D301R樹脂、D315樹脂購(gòu)于安徽省三星樹脂科技有限公司；001×7樹脂、D209樹脂購(gòu)于山東淄博東大樹脂有限公司；AB-8樹脂、ADS-7樹脂、D152樹脂購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；DA201-C樹脂購(gòu)于江西市有機(jī)化工廠。

1.2 主要儀器

QSY凱氏定氮儀（北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心），Z型層析柱φ2.6 cm×40 cm（上海精科實(shí)業(yè)有限公司），HD-3紫外檢測(cè)器（上海滬西分析儀器有限公司），DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器（上海滬西分析儀器廠），SG3電導(dǎo)率儀（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃豆醬多肽的制備

稱取一定質(zhì)量混勻的黃豆醬，按比例加入蒸餾水，搗碎混勻，65℃水浴加熱條件下提取后離心過濾，濾液用10 kDa的超濾膜包過濾，取10 kDa以下溶液冷凍干燥成粉末后備用。

1.3.2 肽含量及鹽含量的測(cè)定

肽含量的測(cè)定采用GB22492-2008的方法[12]，并做適當(dāng)修改。操作過程如下：取40 mL濾液，加50 mL三氯乙酸，混勻并靜止5 min，去除初濾液，濾液作為備用液。吸取25 mL濾液移入凱氏定氮管中，加入0.2 g硫酸銅，6 g硫酸鉀及20 mL硫酸，放在數(shù)控消化爐上消化3 h。待消化液冷卻后，用凱式定氮儀進(jìn)行蒸餾，接收瓶中加入50 mL硼酸，蒸餾5 min，取下接收瓶，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定至藍(lán)紫色為終點(diǎn)，計(jì)算酸溶性蛋白含量。氨基酸含量的測(cè)定[13]：取5.0 mL樣品，定容至100 mL，吸取20.0 mL置于燒杯中，加水60 mL，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05 mol·L-1氫氧化鈉滴定至pH為8.2。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻，再用0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液繼續(xù)滴定至pH=9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，并計(jì)算氨基酸的含量。肽的含量為酸溶性蛋白減去氨基酸含量。

鹽含量的測(cè)定采用GB/T 5009.39-2003[14]，并做適當(dāng)修改。操作過程如下：吸取2 mL試樣于150 mL錐形瓶中，加100 mL去離子水及1 mL鉻酸鉀溶液（3.88 mol·L-1），混勻。用硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mol·mL-1）滴定至初現(xiàn)橘紅色，計(jì)算樣液中鹽含量。

1.3.3 靜態(tài)吸附法篩選樹脂

在250 mL具塞錐形瓶中加入5 mL處理好的濕樹脂，向錐形瓶中加入50 mL濃度為4 mg·mL-1的黃豆醬多肽原液，將錐形瓶放入25℃恒溫?fù)u床中以120 r·min-1振蕩 4 h，過濾，測(cè)定濾液的鹽含量、多肽含量。

1.3.4 洗脫劑的選擇

經(jīng)測(cè)定，黃豆醬多肽原液的pH為4.7～5.0，由于弱酸性物質(zhì)在酸性下吸附，在堿性下洗脫[15]，應(yīng)將洗脫液調(diào)節(jié)為弱堿性。分別選取0%、10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液，用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為8，按1∶10的比例加入飽和樹脂和解析液于具塞三角瓶中，在恒溫?fù)u床中以25℃120 r·min-1振蕩4 h進(jìn)行解析，測(cè)定不同濃度乙醇的解析率。

1.3.5 樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解析

將處理好的樹脂裝入φ2.6 cm×40 cm的層析柱中，在室溫下清洗0.5 h。將濃度為4 mg·mL-1的多肽溶液60 mL上柱，在220 nm的紫外吸光度下檢測(cè)，先用去離子水洗滌層析柱，每10 mL收集一管，測(cè)定流出液的鹽含量和肽含量。待流出液的電導(dǎo)率恒定后，用一定濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并測(cè)定肽含量。

1.3.6 最佳樣品濃度的確定

取黃豆醬多肽粉末，配置成 1、2、4、6 mg·mL-1的濃度進(jìn)行上樣，使用去離子水進(jìn)行洗滌，待電導(dǎo)率恒定后，進(jìn)行洗脫，測(cè)定多肽回收率[9]以便確定最佳進(jìn)樣濃度。

1.3.7 最佳流速的確定

洗脫時(shí)，將恒流泵的流速調(diào)節(jié)至20、30、40、50 r·min-1，測(cè)定洗脫液多肽回收率以選擇最佳流速。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附法篩選樹脂

不同樹脂對(duì)黃豆醬多肽原液的脫鹽率和肽吸附率如表1。

表1 不同樹脂對(duì)黃豆醬多肽的吸附性能Table 1 Adsorption behavior of soybean paste peptide on the adsorbed resins

溶液中離子種類、離子強(qiáng)度、溶液pH決定了目的物與離子交換劑的結(jié)合能力[6]。從表1中看出，陽(yáng)離子交換樹脂001×7肽吸附率最高達(dá)到51.45%，脫鹽率為12.17%。黃豆醬多肽溶液為弱酸性，應(yīng)在酸性條件下被吸附，所以選擇強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂001×7進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 洗脫劑的選擇

將已吸附飽和的樹脂進(jìn)行靜態(tài)洗脫，測(cè)定洗脫液肽含量和鹽含量，結(jié)果如表2。

表2 不同解析劑對(duì)黃豆醬多肽的解析效果Table 2 Effect of different eluents on desorbing soybean paste peptide from 001×7 cation exchange resin

由于分子間吸附力較弱，洗脫比較容易，最常用的洗脫劑是低級(jí)醇[15]。從表2中看出，50%和70%乙醇洗脫效果較好，使樣品從樹脂上解析。由于70%乙醇只比50%乙醇解析率高1.15%，考慮到經(jīng)濟(jì)因素，選取pH為8的50%乙醇溶液為洗脫液。

2.3 樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解析

加樣后，以去離子水清洗層析柱，測(cè)定流出液的鹽和肽含量，繪制強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂001×7對(duì)黃豆醬多肽的動(dòng)態(tài)吸附曲線，如圖1所示；以pH為8的50%乙醇溶液為解析劑，黃豆醬多肽解析量隨體積變化如圖2。

圖1 黃豆醬多肽含量和鹽含量隨洗脫體積變化曲線Fig.1 Curve of salt and peptide content with elution

圖2 黃豆醬多肽解析體積變化曲線Fig.2 Curve of soybean paste peptide content with separating volume change

圖1中，在洗脫體積為60 mL時(shí)達(dá)到含鹽量最大值11.34 mg·mL-1，在洗脫體積為340 mL時(shí)趨于穩(wěn)定，肽含量在180 mL時(shí)達(dá)到最大值0.083 mg·mL-1，380 mL時(shí)呈穩(wěn)定趨勢(shì)，溶液中的鹽基本被洗脫，大量肽被樹脂吸附。從圖2中看出，肽在60 mL到300 mL之間被洗脫，洗脫效果較好。

2.4 最佳樣品濃度的確定

當(dāng)進(jìn)樣量為60 mL，乙醇洗脫流速為30 r·min-1時(shí)，多肽回收率與樣品濃度的關(guān)系如圖。

圖3 樣品濃度對(duì)黃豆醬多肽回收率的影響Fig.3 Effects of sample densities on recovery rate of soybean paste peptides

適當(dāng)?shù)臉悠窛舛饶苁苟嚯呐c樹脂充分結(jié)合，增加多肽的吸附，提高多肽回收率。從圖3中看出，樣品濃度在1～4 mg·mL-1之間，多肽回收率呈上升趨勢(shì)，在 6 mg·mL-1時(shí)有所下降。選取4 mg·mL-1為最佳進(jìn)樣濃度。

2.5 最佳流速的確定

進(jìn)樣量為60 mL，樣品濃度為4 mg·mL-1時(shí)，乙醇洗脫流速與多肽回收率的關(guān)系如圖4。

圖4 流速對(duì)黃豆醬多肽回收率的影響Fig.4 Effects of flow rate on recovery rate of soybean paste peptides

從圖中看出隨著洗脫速度的加快，多肽的回收率呈下降趨勢(shì)，說明流速越慢多肽回收率越高。但脫鹽效果隨之下降，綜合考慮，選取30 r·min-1為最佳洗脫速度。

3 結(jié)論

3.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)表明，強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂001×7對(duì)黃豆醬多肽溶液同時(shí)具有較好的脫鹽率和肽吸附率。

3.2 該樹脂對(duì)黃豆醬多肽溶液動(dòng)態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)表明，最佳脫鹽工藝條件為進(jìn)樣濃度4 mg·mL-1，洗脫劑為pH 8的50%乙醇溶液，流速為30 r·min-1。脫鹽率達(dá)到91.28%，回收率為88.54%。

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