張元元，李耀康，王 敏，尹紅春，王光明

（大理學院臨床醫(yī)學院，云南大理 671000）

過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator activated receptors，PPARs） 是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子〔1〕，目前已經(jīng)確認有三種亞型：PPARα，β，γ（又稱為δ或NUC1）。研究認為PPARs參與了脂類、糖類代謝、脂肪細胞的分化，因此，在代謝綜合征的治療方面，PPARs作為潛在的分子治療靶點而備受關(guān)注〔2〕。

Fibrates最早作為降脂、降膽固醇藥物在臨床中應(yīng)用〔3〕，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)Fibrates是PPARα的配體〔4〕。除了降脂、降膽固醇作用以外，還具有抗炎、抗氧化的作用〔5〕。有研究顯示，在大鼠肺移植模型中，Wy14643（PPARα特異的配體）能夠通過上調(diào)IL-4，IL-10和TGFβ的表達以降低急性排斥〔6〕，但是在移植物耐受中，其主要機制是抑制免疫反應(yīng)、抑制成熟型T細胞的形成、記憶型T細胞的形成等。然而，Wy14643是否與之有關(guān)，以及另外一種PPARα的配體：Fenofibrate是否也具有相似的作用還不清楚。因此本實驗我們利用Fenofibrate或者Wy14643處理的小鼠的脾細胞與處女型小鼠的脾細胞進行混合淋巴細胞反應(yīng)，以初步探討Fenofibrate或者Wy14643在誘導移植耐受中的作用，為將來利用Fenofibrate或者Wy14643對移植物進行干預(yù)以誘導移植耐受奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料C57BL/6J和BALB/c小鼠，六周齡，雄性，購自Charles River（Wilminton，MA，USA），RPMI1640培養(yǎng)基，F(xiàn)enofibrate、Wy14643和MTT試劑盒購自Sigma公司（St.Louis，MO，USA）和PPARαEMSA試劑盒購自Panomics公司（Fremont，CA，USA）。

1.2方法

1.2.1 動物處理 C57BL/6J小鼠每天經(jīng)口灌胃1次，每次Fenofibrate，Wy14643（分別為30 mg/mL/kg體重，溶液濃度為3 mg/mL/kg體重），或者CMC（carboxymethyl cellulose）10 mL/kg體重，連續(xù)7 d，每組12只小鼠。

1.2.2 混合淋巴細胞反應(yīng) 在Fenofibrate，Wy14643或者CMC處理7 d后，以正常品系的C57BL/6J小鼠為對照，分別測定BALB/c小鼠脾細胞對藥物處理的C57BL/6J小鼠的脾細胞的混合淋巴細胞反應(yīng)，具體方法如下：無菌條件下取C57BL/6J小鼠的脾臟，以RPMI1640培養(yǎng)基制成脾細胞懸液，臺盼藍染色計算活細胞數(shù)，用完全RPMI1640調(diào)整細胞濃度至5×105個/mL，作為反應(yīng)細胞。另取正常BALB/c小鼠脾臟，用相同的方法制成脾細胞懸液，并調(diào)節(jié)至相同的濃度，25 Gy照射或者不照射刺激細胞，進行單向和雙向混合淋巴細胞反應(yīng)。刺激細胞和反應(yīng)細胞各取100 μL加入96孔培養(yǎng)板中，每組做9個孔，其中每3個孔為復(fù)孔（來源于1只小鼠）。39℃孵育72 h后參照文獻〔7〕的方法進行。重復(fù)3次（總共9只小鼠）。

1.2.3 EMSA實驗 取經(jīng)Fenofibrate，Wy14643或者CMC處理的C57BL/6J小鼠脾臟，分離脾細胞，然后提出核蛋白，根據(jù)Panomics公司的PPARαEMSA試劑盒說明書進行EMSA實驗，每組分別取3只動物的脾臟進行實驗。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 組間用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理。首先進行one-way ANOVA分析，然后再進行Scheffle post hoc統(tǒng)計學分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EMSA結(jié)果分離C57BL/6J小鼠脾細胞，提出核蛋白進行EMSA實驗，見圖1。經(jīng)Fenofibrate或者Wy14643處理，PPARα特異條帶明顯強于CMC處理組。

2.2 MLR結(jié)果在Fenofibrate或者Wy14643處理7 d后，藥物處理組的C57BL/6J小鼠脾細胞對處女型BALB/c小鼠脾細胞的單向和雙向混合淋巴細胞反應(yīng)特異性降低（與正常對照組和CMC處理組相比，P＜0.01），見圖2。說明Fenofibrate或者Wy14643能夠抑制小鼠的脾細胞對抗原的刺激作用。

3 討論

圖1 EMSA結(jié)果

圖2 混合淋巴細胞反應(yīng)結(jié)果（n＝3）

C57BL/6J小鼠經(jīng)過Fenofibrate或者Wy14643處理后，EMSA結(jié)果顯示，在加入過量的無標記的PPARα探針時，僅僅出現(xiàn)較弱的背景，CMC處理的小鼠，其PPARα條帶強弱與對照組相似；而Fenofibrate或者Wy14643處理組，有活性的PPARα條帶明顯增強，說明Fenofibrate或者Wy14643能夠增加小鼠脾細胞內(nèi)的PPARα的活性部分。有研究顯示，在人胚胎時期，脾細胞上有PPARα的表達〔8〕，在大鼠脾臟中，PPARα的表達隨著年齡的增加而發(fā)生改變〔9-10〕；由于人體實驗的特殊性，在對小鼠的研究時發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過PPARα的配體：Wy14643、PUFA和Gemfibrozil處理，能夠使脾臟中的PPARα在mRNA水平和蛋白水平表達升高〔9，11-13〕，但是PPARα的mRNA水平和蛋白水平表達升高并不能夠完全代表表達的PPARα是否具有活性，因此本研究利用EMSA的方法檢測經(jīng)過Fenofibrate或者Wy14643處理的小鼠脾細胞中PPARα的活性情況，結(jié)果顯示Fenofibrate或者Wy14643處理能夠使PPARα的活性升高。

在移植免疫中，單向混合淋巴細胞反應(yīng)是研究受體免疫細胞是否對供體來源的抗原刺激具有應(yīng)答效應(yīng)。在我們的研究中顯示，處女型BALB/c小鼠（相當于移植時的供體）的脾細胞經(jīng)滅活后作為抗原刺激C57BL/6J小鼠（受體）的脾細胞，CMC處理的小鼠，其混合淋巴細胞反應(yīng)無改變，說明CMC作為藥物的溶劑是安全的，而小鼠經(jīng)過Fenofibrate或者Wy14643處理后，其混合淋巴細胞反應(yīng)降低；而在雙向混合淋巴細胞反應(yīng)中，F(xiàn)enofibrate或者Wy14643處理C57BL/6J小鼠的脾細胞作為刺激細胞，仍然能夠有效的激活處女型BALB/c小鼠的脾細胞，結(jié)合EMSA的實驗結(jié)果，說明Fenofibrate或者Wy14643可能通過促進PPARα的表達及其增加有活性PPARα的含量，然后通過某種信號通路以抑制淋巴細胞對抗原刺激的反應(yīng)，F(xiàn)ang等人的研究結(jié)果〔9〕顯示，另外一種PPARα的配體：perfluorononanoic acid（PFNA）處理BALB/c小鼠，對免疫系統(tǒng)細胞的增殖、細胞凋亡等沒有影響；而Qazi等人〔14〕利用PPARα基因敲除小鼠和Cunard等人〔11〕利用Wy14643處理小鼠研究顯示，與同齡小鼠相比，其脾臟中淋巴細胞數(shù)量、形態(tài)等沒有區(qū)別，但是炎癥因子：腫瘤壞死因子（TNF-alpha），白介素6（IL-6）和干擾素-gamma（IFN-gamma）的含量升高，而且激活后的脾細胞其細胞凋亡率升高，該效應(yīng)是PPARα依賴的，以上結(jié)果說明fenofibrate或者Wy14643可以通過激活PPARα以發(fā)揮免疫抑制作用，是一類在器官移植中具有免疫抑制效果的免疫抑制劑。

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