劉宗文，馮天平，趙景志，田薇薇，韓 娜，孫淼淼，婁 欣，胡愛俠

(1.鄭州大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450014;2.鄭州大學公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001;3.河南省腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450003;4.鄭州市中心醫(yī)院，河南 鄭州 450052;5.商丘市中心醫(yī)院，河南 商丘 476000)

人類線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的全部核苷酸序列分析已由劍橋分子生物學研究所完成，人類mtDNA的核苷酸序列全長為16569 bp，呈雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)［1-2］。mtDNA分為非編碼區(qū)(D-LOOP區(qū))和編碼區(qū)。mtDNA編碼區(qū)含有37個編碼基因，分別編碼2個rRNA、22個tRNA和13個編碼呼吸鏈復合物亞單位的蛋白質(zhì)。mtDNA中ND1基因為線粒體編碼的13個蛋白多肽中復合體I(NADH-CoQ還原酶)的亞基。線粒體參與細胞的代謝、凋亡、衰老以及腫瘤的發(fā)生等生理和病理的代謝過程［3-4］。研究［5］已經(jīng)表明mtDNA的異常與人類多種腫瘤關(guān)系密切。通過對人食管鱗癌EC9706細胞mtDNA中ND1基因進行檢測，了解mtDNA中ND1基因是否有突變，作者曾在以往的研究［6-8］中發(fā)現(xiàn)人食管鱗癌中mtDNA編碼ND1基因拷貝數(shù)是增加的，如果使得mtDNA編碼ND1基因的表達下調(diào)，就可能達到治療目的，進而為食管癌的治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人食管癌細胞系 人食管鱗癌EC9706細胞株由中國醫(yī)學科學院國家分子腫瘤重點實驗室饋贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清(天津TBD公司);PCR擴增試劑盒(上海Sangon公司);mtDNA引物、線粒體提取試劑和mtDNA萃取試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司);尿嘧啶、丙酮酸(美國Sigma公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國GMBH公司);BCM-100A型生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣凈化公司);高速低溫離心機(德國Heraeus公司);DNA熱循環(huán)擴增儀(德國Biometra公司)。

1.1.3 引物設計 mtDNA的ND1基因引物(3059～4015，956 bp)序列如下:上游引物(MAF):5’-TTACTCCTGCCATCATGACC-3’，下游引物 (MAR):5’-AGAATGATGGCTAGGGTGAC-3’，擴增片段長度為956 bp。上述引物由上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞的復蘇及培養(yǎng) 從液氮中取出人食管鱗癌EC9706細胞凍存管，迅速放入37℃水浴1～2 min使之融化;吸取細胞懸液，加入適量培養(yǎng)基;1000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)基，重復離心2次;用含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基適當稀釋后，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)基。以后按常規(guī)進行培養(yǎng)。

1.2.2 人食管鱗癌EC9706細胞mtDNA中ND1基因測序 提取mtDNA的ND1基因，PCR擴增ND1基因，用mtDNA的ND1基因引物(3059～4015，956 bp)，得到PCR反應產(chǎn)物。經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進行測序。

2 結(jié)果

人食管鱗癌EC9706細胞mtDNA中ND1基因測序結(jié)果:經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)EC9706細胞中的3971處出現(xiàn)點突變，由C突變?yōu)門，其堿基序列和測序圖見圖1、2。

3 討論

人類的mtDNA全部核苷酸序列分析測定已經(jīng)完成。mtDNA存在于線粒體內(nèi)膜上，是惟一的核外遺傳物質(zhì)。目前的研究［9］已經(jīng)表明mtDNA的異常與人類多種腫瘤的關(guān)系密切。mtDNA分為非編碼區(qū)(DLOOP區(qū))和編碼區(qū)。對于D-LOOP區(qū)的研究一直較熱，但尚無定性結(jié)論。對于編碼區(qū)的研究目前較少，對這些mtDNA突變或功能異常所發(fā)生的分子遺傳機制的研究，可以闡明腫瘤的發(fā)病機制、mtDNA的表達情況、mtDNA與核DNA的相互作用及協(xié)調(diào)一致表達的機制，并為腫瘤的治療提供理論指導［10］。

本實驗對人食管鱗癌 EC9706細胞mtDNA中ND1基因進行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人食管鱗癌EC9706細胞mtDNA中ND1基因的3971處出現(xiàn)點突變，由C突變?yōu)門，這種突變可能是腫瘤發(fā)病的原因。

研究［11］顯示，細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后關(guān)系密切。由于mtDNA與體內(nèi)能量代謝相關(guān)，所以mtDNA突變或功能異常容易導致能量合成減少，進而引發(fā)細胞衰老、死亡和凋亡，細胞發(fā)生凋亡或壞死受多種因素調(diào)控，其中mtDNA突變或功能異?；蛟S就是諸多調(diào)控因素之一［12-16］。

根據(jù)上述研究成果，Uchida等［14］用莫法羅汀處理乳腺癌細胞系ZR-75-I和MCF-7，發(fā)現(xiàn)了mtDNA編碼ND1基因的表達下調(diào)，提示化療藥物可能通過抑制mtDNA的轉(zhuǎn)錄水平達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。本研究與上述諸多學者思路和結(jié)果一致，mtDNA的突變或功能異?？纱龠M細胞凋亡從而達到抑制細胞增殖的目的，這為食管癌的治療提供了新的思路，有可能通過特異性降低腫瘤細胞的mtDNA來治療腫瘤。另外，腫瘤細胞線粒體膜極性增加，腫瘤細胞mtDNA可能成為親脂性陽離子化療藥物的選擇性作用部位。這些研究將使食管癌的治療出現(xiàn)新的希望。

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