喬玉莉，黃宗帥，田月如，關(guān) 明，蔣曉飛

（1. 普洱市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 普洱 665000；2. 湘雅常德醫(yī)院，湖南 常德 415000；3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040）

隨著抗菌藥物、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用及侵入性醫(yī)療操作的開(kāi)展，顱內(nèi)感染成為神經(jīng)外科患者治療過(guò)程中最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其致殘率和致死率較高，治療難度較大。常規(guī)腦脊液培養(yǎng)是將腦脊液濃縮集菌后培養(yǎng)，獲取單個(gè)菌落后再進(jìn)行鑒定和藥物敏感性分析，耗時(shí)，且陽(yáng)性率低，無(wú)法滿(mǎn)足臨床抗感染治療需求。張?chǎng)蔫吹萚1]發(fā)現(xiàn)，采用血培養(yǎng)瓶進(jìn)行腦脊液培養(yǎng)能提高腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性率，縮短培養(yǎng)時(shí)間?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可直接鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本[2-3]及中段尿[4-5]、無(wú)菌體液[6]等臨床樣本中的病原微生物?；诖?，我們開(kāi)發(fā)了“直接將腦脊液注入血培養(yǎng)瓶進(jìn)行增菌培養(yǎng)，報(bào)陽(yáng)后直接離心富集細(xì)菌，采用MALDI-TOF MS快速鑒定，并直接進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)”的快速腦脊液培養(yǎng)細(xì)菌鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)的方法，并與常規(guī)的腦脊液濃縮集菌后培養(yǎng)，獲取菌落后再進(jìn)行鑒定和藥物敏感性分析進(jìn)行比較，不一致的鑒定結(jié)果以測(cè)序結(jié)果為參考，評(píng)估快速鑒定和快速體外藥物敏感性試驗(yàn)方法的可行性與臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2018年12月—2019年7月華山醫(yī)院檢驗(yàn)科送檢的1 446例腦脊液樣本，隨機(jī)抽取345例按血培養(yǎng)瓶增菌法進(jìn)行培養(yǎng)，報(bào)陽(yáng)后，分別采用BD凝膠分離血清管直接離心集菌（快速法）富集細(xì)菌和常規(guī)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)（常規(guī)法）獲取純細(xì)菌，革蘭陰性菌及革蘭陽(yáng)性菌同時(shí)采用紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法和Vitek 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀（儀器法）進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，隱球菌采用ATB FUNGUS2藥物敏感性試驗(yàn)紙條進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)；其他1 101例采用常規(guī)濃縮集菌培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，有細(xì)菌生長(zhǎng)的樣本通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)種獲取純細(xì)菌后進(jìn)行鑒定。

1.2 儀器與試劑

Micro flex LT型MALDI-TOF MS儀、MSP 96孔靶板、IVD細(xì)菌測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品和α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)均購(gòu)自德國(guó)Bruker Daltonik公司，BACTECTMFX血培養(yǎng)系統(tǒng)、需氧血培養(yǎng)瓶、厭氧血培養(yǎng)瓶及真菌/分枝桿菌血培養(yǎng)瓶、BD凝膠分離血清管（SST管3.5 mL）均購(gòu)自美國(guó)BD公司，BacT/Alert 3D、Vitek 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀、需氧血培養(yǎng)瓶、厭氧血培養(yǎng)瓶、AST-P639鑒定卡、AST-N335鑒定卡、酵母樣真菌藥敏試劑盒均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。血平板、巧克力平板及中國(guó)藍(lán)平板均購(gòu)自上?？片敿喂?，葡萄球菌藥敏板、腸桿菌科藥敏板均購(gòu)自溫州康泰公司，甲酸購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.3 方法

1.3.1 鏡檢 挑取血培養(yǎng)儀中報(bào)陽(yáng)的腦脊液血培養(yǎng)瓶中菌落，涂片并革蘭染色，顯微鏡下觀察結(jié)果，并記錄。

1.3.2 MALDI-TOF MS鑒定 腦脊液快速鑒定方法參考AZRAD等[7]的改良方法，并稍作修改：從每個(gè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移5 mL到血清分離膠管，1 237×g離心10 min，棄上清。取出沉淀物并置于1.5 mL Eppendorf管中，17 949×g離心1 min，棄上清。用無(wú)菌去離子水洗2遍。取1 μL沉淀置于MSP 96孔靶板上，各靶點(diǎn)覆蓋1 μL 70%的甲酸，干燥后，再加入1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液，采用Microflex LT系統(tǒng)和MALDI BIOTYPER 3.0軟件進(jìn)行質(zhì)譜分析。純培養(yǎng)物是由陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)種至血平板，培養(yǎng)過(guò)夜后挑取的單個(gè)菌落，將其均勻涂抹在MSP 96孔靶板上，進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。根據(jù)STEVENSON等[8]提出的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合文獻(xiàn)[4，9-10]，每個(gè)樣本點(diǎn)樣4次，當(dāng)至少有2次結(jié)果一致，且第1個(gè)鑒定分?jǐn)?shù)≥1.4時(shí)，判定為鑒定準(zhǔn)確。

1.3.3 快速和常規(guī)體外藥物敏感性試驗(yàn) 快速藥物敏感性試驗(yàn)直接取上述細(xì)菌沉淀物，常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)取血培養(yǎng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)種至血平板上的菌落，分別配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，分別采用紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法和儀器法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。隱球菌快速和常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)板嚴(yán)格按照酵母樣真菌藥敏試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，采用顯色微量肉湯稀釋法檢測(cè)入組菌株5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、糞腸球菌（ATCC 29212），購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

結(jié)果判讀和數(shù)據(jù)分析按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018年版標(biāo)準(zhǔn)，替考拉寧參考CLSI 2016年版標(biāo)準(zhǔn)，替加環(huán)素參照歐州藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）2012版標(biāo)準(zhǔn)。一致率參照CLSI商品化微生物鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)系統(tǒng)相關(guān)指南要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 17.0軟件及WHONET 5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法與常規(guī)濃縮集菌培養(yǎng)法報(bào)陽(yáng)時(shí)間及陽(yáng)性率的比較

腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌培養(yǎng)法與常規(guī)濃縮集菌培養(yǎng)法的陽(yáng)性率分別是13.91%（48/345）和2.91%（32/1 101），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=60.889，P=0.000）。腦脊液樣本血培養(yǎng)瓶增菌法臨床常見(jiàn)細(xì)菌的平均報(bào)陽(yáng)時(shí)間是（1.95±0.77）d，而常規(guī)濃縮集菌培養(yǎng)臨床常見(jiàn)細(xì)菌的平均檢出時(shí)間為（1.67±0.41）d，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.605，P=0.119）；2種方法檢出真菌的時(shí)間分別為（2.16±0.60）和（3.9 2±1.0 8）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.497，P=0.002）。血培養(yǎng)瓶增菌法報(bào)陽(yáng)細(xì)菌中革蘭陰性桿菌、革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陽(yáng)性桿菌及真菌分布情況分別為16.33%（8/49）、34.69（17/49）、10.20%（5/49）及38.78%（19/49），常規(guī)濃縮集菌培養(yǎng)法分別為43.75%（14/32）、34.38%（11/32）、6.24%（2/32）及15.63%（5/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.212，P=0.027）。

2.2 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本快速法與常規(guī)法鑒定結(jié)果的比較

采用常規(guī)轉(zhuǎn)種方法從48份腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本中分離鑒定出49株細(xì)菌，而采用快速法鑒定出44株細(xì)菌，快速法未能鑒定出的5株細(xì)菌來(lái)自4例樣本，分別是：混合感染1例、陽(yáng)性球菌2例和真菌1例，符合率為89.80%，見(jiàn)表1?？焖俜ㄨb定出7株革蘭陰性菌（混合感染未鑒定出）和5株革蘭陽(yáng)性桿菌，與常規(guī)法鑒定結(jié)果相符。常規(guī)法鑒定的17株革蘭陽(yáng)性球菌中，快速法鑒定出12株葡萄球菌（包含1株厭氧的解糖葡萄球菌）、2株藤黃微球菌、1株葡萄球菌和1株鏈球菌（鑒定到屬），另外1株細(xì)菌因混合感染而未鑒定出，此3株未納入快速法鑒定的陽(yáng)性率計(jì)算中，但鑒定到屬的樣本仍舊做了快速藥物敏感性試驗(yàn)。常規(guī)法鑒定的19株真菌中，快速法鑒定出15株新型隱球菌、2株念珠菌和1株皮炎外瓶霉，有1株革蘭染色似隱球菌，常規(guī)法鑒定到屬、快速法未鑒定出，后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為新型隱球菌。2種方法鑒定結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.116，P=0.990）。

表1 快速法與常規(guī)法鑒定結(jié)果比較

2.3 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本快速法與常規(guī)法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較

2.3.1 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本革蘭陰性菌快速法與常規(guī)法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較 快速法鑒定出7株革蘭陰性菌，混合感染未鑒定出，無(wú)法比較藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果；另外1株嗜麥芽窄食假單胞菌無(wú)相應(yīng)藥敏卡，未使用儀器法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，未統(tǒng)計(jì)；紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法只選擇左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、米諾環(huán)素和頭孢他啶-他唑巴坦4種抗菌藥物。3種藥物敏感性試驗(yàn)方法中僅有微量肉湯稀釋法的替加環(huán)素分類(lèi)一致率為83.33%（5/6），其他抗菌藥物分類(lèi)一致率均為100%。

2.3.2 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本革蘭陽(yáng)性球菌快速與常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較 革蘭陽(yáng)性球菌的3種藥物敏感性試驗(yàn)中，紙片擴(kuò)散法紅霉素分類(lèi)一致率為84.62%（11/13），微量肉湯稀釋法紅霉素和慶大霉素分別為84.62%（11/13）和91.67%（11/12）；儀器法克林霉素和慶大霉素分類(lèi)一致率均為91.67%（11/12），其他抗菌藥物（阿米卡星、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、亞胺培南、美羅培南、米諾環(huán)素、頭孢他啶-他唑巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑、替加環(huán)素）快速法和常規(guī)法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果完全一致。

2.3.3 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本隱球菌快速法與常規(guī)法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確率 快速法鑒定出15株新型隱球菌，1株革蘭染色似隱球菌，但未鑒定出結(jié)果，常規(guī)應(yīng)鑒定到屬，后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為新型隱球菌，也納入隱球菌分別進(jìn)行快速法與常規(guī)法藥物敏感性試驗(yàn)。2種藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果完全一致。

2.3.4 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本標(biāo)準(zhǔn)一致性比較 以純培養(yǎng)微量肉湯稀釋法為標(biāo)準(zhǔn)，快速微量肉湯稀釋法和快速儀器法的標(biāo)準(zhǔn)一致率分別為98.56%（273/277）和97.83%（271/277），快速微量肉湯稀釋法的微小錯(cuò)誤率分別為1.44%（4/277），快速儀器法的錯(cuò)誤率為2.17%（6/277），見(jiàn)表2。

表2 腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法陽(yáng)性樣本快速法藥物敏感性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)一致率 株（%）

3 討論

MALDI-TOF MS相對(duì)于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，可以更快速、準(zhǔn)確地鑒定出血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本中的細(xì)菌，縮短血培養(yǎng)報(bào)告結(jié)果的時(shí)間，為臨床提供更為及時(shí)、準(zhǔn)確的用藥指導(dǎo)。由于腦脊液中細(xì)菌含量少，且陽(yáng)性率較低，一定程度上限制了其應(yīng)用，很多學(xué)者借助MALDI-TOF MS積極尋找有效且快速的檢測(cè)方法[11-13]。為縮短藥物敏感性試驗(yàn)的報(bào)告時(shí)間，本研究在分離膠-質(zhì)譜法快速鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上，以增菌后分純?nèi)【蔫b定和藥物敏感性試驗(yàn)為常規(guī)方法，并以此為標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法和儀器法分別對(duì)快速鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)估。

本研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)與血培養(yǎng)瓶增菌培養(yǎng)腦脊液樣本臨床常見(jiàn)細(xì)菌的報(bào)陽(yáng)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.119），而真菌的報(bào)陽(yáng)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），這可能與2種方法的培養(yǎng)時(shí)間不同有關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)的陽(yáng)性率較血培養(yǎng)增菌培養(yǎng)低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），與文獻(xiàn)報(bào)道[3]相符。本研究中，血培養(yǎng)瓶增菌法對(duì)難培養(yǎng)的真菌，尤其是隱球菌的檢出率明顯提高，提示腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法不但未影響其報(bào)陽(yáng)時(shí)間，還提高了總體陽(yáng)性率及真菌的檢出率，證實(shí)了腦脊液血培養(yǎng)瓶增菌法的優(yōu)越性。

本研究中，直接離心富集的快速法與常規(guī)法相比，能快速鑒定腦脊液血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本中的絕大多數(shù)病原菌，且2種方法鑒定結(jié)果符合率達(dá)89.80%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？焖俜ㄅc常規(guī)法鑒定結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，直接離心集菌后采用MALDI-TOF MS鑒定革蘭陰性菌的符合率優(yōu)于革蘭陽(yáng)性菌，可能與革蘭陽(yáng)性菌壁厚、菌體小有關(guān)，與李媛睿等[14]的報(bào)道基本一致。方毅等[15]、馬堅(jiān)等[16]在血培養(yǎng)快速鑒定中也報(bào)道了相似的鑒定結(jié)果。本研究腦脊液血培養(yǎng)鑒定的隱球菌所占比例較高，可能與醫(yī)院收治患者類(lèi)型有關(guān)。綜上所述，本研究認(rèn)為直接使用報(bào)陽(yáng)樣本沉淀物快速鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

以常規(guī)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)法的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果為參考，本研究主要比較了革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性球菌及隱球菌的直接離心法快速藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)快速藥物敏感性試驗(yàn)與常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果高度一致，提示快速藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果在指導(dǎo)臨床抗菌藥物使用方面有較大的參考價(jià)值。另外，為檢驗(yàn)快速藥物敏感性試驗(yàn)（快速微量肉湯稀釋法和快速儀器法）結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究以純培養(yǎng)微量肉湯稀釋法為標(biāo)準(zhǔn)，快速微量肉湯稀釋法和快速儀器法的標(biāo)準(zhǔn)一致率分別為98.56%和97.83%，顯示快速藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果具有較高的臨床可信度。

常規(guī)轉(zhuǎn)種過(guò)夜孵育取菌的藥物敏感性試驗(yàn)是推薦方法，其結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。但是采用常規(guī)操作流程，從陽(yáng)性報(bào)警到藥物敏感性試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果用時(shí)較長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)抗菌藥物治療延遲會(huì)造成患者病死率上升、住院日延長(zhǎng)和醫(yī)療費(fèi)用增加等嚴(yán)重后果[17]。本研究中，將腦脊液注入血培養(yǎng)瓶后，陽(yáng)性率及培養(yǎng)菌株的多樣性有明顯優(yōu)勢(shì)，結(jié)合直接取菌后采用MALDI-TOF MS快速鑒定結(jié)果，腦脊液增菌培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的快速與常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果高度相符，大大縮短了報(bào)告時(shí)間，對(duì)臨床用藥提供了快速、準(zhǔn)確的依據(jù)。本研究也存在一定局限性，收集樣本量偏少，可能使結(jié)果不夠全面，后續(xù)將增加樣本量及菌種的多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。