張 亮， 袁 爭， 朱 蔚， 高旭暉

（農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學與生物技術(shù)重點實驗室，合肥 230036）

茶炭疽病是常見的茶樹葉部病害之一，在我國各產(chǎn)茶區(qū)均有發(fā)生，山區(qū)茶園尤為普遍，除茶樹外，還危害山茶、油茶等植物［1]。茶炭疽病主要危害當年生成葉，大流行時可致茶樹樹勢衰落，大量落葉，產(chǎn)量降低［2]。生產(chǎn)上人們往往使用見效快的化學農(nóng)藥來防治此病，但由于長期施用化學農(nóng)藥導致的農(nóng)藥殘留問題、抗藥性問題愈加突出，與當下大力倡導的有機茶生產(chǎn)形勢相悖。生物農(nóng)藥的活性成分是自然界存在的物質(zhì)，有順暢的降解途徑，這些成分易分解、安全間隔期短，對作物不產(chǎn)生藥害［3]，生物農(nóng)藥在茶樹病蟲防治方面已有了應用，如茶樹內(nèi)生菌對茶樹病害的控制作用［4]，而植物源藥劑尚無報道。本文研究了4種植物的丙酮提取物對茶炭疽病菌的抑制作用，旨在為茶樹病害的無公害防治開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物及溶劑

側(cè)柏（Platycladus orientalis）葉、香樟（Cinnamomum camphora）葉、艾蒿（Artemisia argyi）（均采自安徽農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)）、蘆柑（Citrus madurensis）（周谷堆農(nóng)貿(mào)市場購買）；丙酮（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；水瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.3 供試病原菌

從安徽農(nóng)業(yè)大學教學科研示范基地采取茶炭疽病葉，分離，經(jīng)顯微觀察鑒定證實為茶炭疽病菌，單孢分離純培養(yǎng)獲得。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取物的制備

將側(cè)柏葉、香樟葉、蘆柑皮、艾蒿莖葉洗凈，置于恒溫箱中50℃烘干至恒重，中藥粉碎機粉碎（50～200目），密封保存。分別稱取適量各干粉于丙酮中，在40℃恒溫氣浴振蕩器中提取5h后經(jīng)抽濾獲得提取液。采用旋轉(zhuǎn)濃縮的方法將提取液濃縮至膏狀，真空干燥以除去殘余的丙酮，稱重，用丙酮定容，獲得相應濃度的提取物。

1.2.2 對炭疽菌菌絲生長的抑制

采用菌絲生長速率法［5]測定不同濃度的提取物的抑菌活性。將各提取物分別配成15 000、10 000、7 500、5 000、1 000μg／mL的濃度，在無菌條件下，向50mL已滅菌的燒杯中加入3mL各濃度的提取物，再加入27mL融化了的冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基，充分搖勻后倒入培養(yǎng)皿中制成平板，每板10mL，3次重復。此時的濃度為原濃度的1／10。以等量的丙酮和培養(yǎng)基作對照。參照江茂生的方法［6]，將培養(yǎng)基放置在通風櫥中3d，以揮發(fā)去除溶劑丙酮，接入長勢一致的6mm菌餅，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定時觀察菌絲生長情況，分別在48、72、96、120h用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。用DPS軟件進行差異顯著性分析。采用96h的菌絲生長抑制率作為計算有效中濃度EC50的數(shù)據(jù)。以濃度對數(shù)為自變量（x），以抑制率幾率值為因變量（y）計算提取物的毒力回歸曲線和EC50。

1.2.3 對分生孢子萌發(fā)的抑制

采用水瓊脂培養(yǎng)法［5]測定提取物對孢子萌發(fā)的抑制作用。選取培養(yǎng)7d菌株的PDA平板，在平板中加入適量無菌水，晃動，過濾，即獲得孢子懸浮液。將孢子懸浮液配成1×105個／mL的濃度。提取物的濃度配制及平板的制作程序與1.2.2方法相同。將孢子懸浮液滴入處理好的含提取物的水瓊脂平板中，并在培養(yǎng)皿背面畫圈標記滴入點位置以便觀察，每板3點，每點20μL，即3次重復。將各處理置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組90%以上萌發(fā)時觀察并計算孢子萌發(fā)率。觀察前，先將各處理放入4℃冰箱中，以阻止孢子繼續(xù)萌發(fā)。顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，以每視野下能觀察到的80～100個孢子為記錄對象。

2 結(jié)果與分析

2.1 對菌絲生長的抑制作用

結(jié)果表明：1 500μg／mL濃度下，各提取物對菌絲的生長都有較好的抑制作用。其中蘆柑皮提取物的抑制效果最好，48h抑制率達100%，余者依次是艾蒿、香樟葉和側(cè)柏葉。各提取物抑制率隨著時間的延長有下降的趨勢。蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側(cè)柏葉96h的抑制率分別為93.32%、61.10%、55.64%和48.20%（表1，圖1）。

表1 1 500μg／mL濃度提取物對茶樹炭疽病菌菌絲的抑制作用1）

圖1 1 500μg／mL不同植物提取物對茶樹炭疽病菌菌絲96h抑制效果

通過對菌絲形態(tài)觀察，1 500μg／mL濃度的蘆柑皮、艾蒿處理的菌株48、72h皆出現(xiàn)大量氣生菌絲。蘆柑皮1 500μg／mL濃度處理的菌株，菌絲48h未能擴展，完全被抑制，之后擴展的菌落邊緣不圓整，略呈鋸齒狀，且各濃度都出現(xiàn)不圓整狀況，120h時100μg／mL濃度的得以恢復，高濃度的尚未能恢復，艾蒿、香樟葉和側(cè)柏葉均不見此種狀況。

通過Excel軟件計算了提取物的毒力回歸曲線及EC50（表2）。蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側(cè)柏葉各提取物的EC50分別為8.981、839.575、1 058.682μg／mL 和1 429.094μg／mL。側(cè)柏的毒力曲線斜率最大，說明在所設(shè)的濃度梯度范圍內(nèi)，濃度的變化對菌絲的影響最大。蘆柑皮的斜率最小，香樟葉與艾蒿的斜率相當。

表2 植物提取物對茶炭疽病菌菌絲生長的抑制作用

2.2 對分生孢子萌發(fā)的抑制作用

1 500μg／mL濃度蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側(cè)柏葉對孢子萌發(fā)的抑制率分別為34.85%、85.54%、55.40%和59.68%（圖2）。除蘆柑皮外，其余提取物均表現(xiàn)出較好的抑制萌發(fā)作用。提取物毒力曲線及EC50如表3所示。蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側(cè)柏葉對孢子萌發(fā)的 EC50分別為5 764.142、281.121、1 502.49μg／mL和969.369μg／mL。

圖2 植物提取物對茶炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率

表3 植物提取物對茶炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用

3 結(jié)論與討論

4種植物的丙酮提取物對茶炭疽病菌菌絲均有很好的抑制作用，其中蘆柑皮抑菌效果顯著。艾蒿對菌絲抑制效果相對香樟葉和側(cè)柏葉雖無顯著差異，但對孢子萌發(fā)的抑制顯著。江茂生等2007年報道艾蒿乙醇提取物對多種病原菌有較好的抑制作用［6]，可見艾蒿的抑菌作用具有一定的廣譜性。蘆柑皮對茶炭疽病菌絲生長的抑制作用顯著，而對孢子萌發(fā)的抑制率遠遠低于另外3種提取物，這可能是因為其中的活性物質(zhì)抑菌機理不同。文獻鮮有對蘆柑皮防治植物病原菌的報道，肖琳等2010年報道柚皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分對蘋果腐爛病菌、辣椒炭疽菌和棉花枯萎菌等植物病原菌有較高的抑制作用［7]，并將其活性成分推測為黃酮類化合物。蘆柑皮丙酮提取物對菌絲的EC50達8.981μg／mL，其EC50更是優(yōu)于肖琳等對柚皮的報道，這可能也是與蘆柑皮中富含黃酮類化合物［8]有關(guān)，因為黃酮類化合物具有廣譜的抗菌作用［9]。本試驗中蘆柑皮毒力曲線的線性不好，可能是提取物成分復雜，活性成分多樣化，蘆柑皮中的黃酮類化合物和其他活性成分協(xié)同作用造成的，其抑菌活性成分還需分離純化逐一探明。進一步研究蘆柑皮、艾蒿丙酮提取物中的活性物質(zhì)對于植物源殺菌劑的開發(fā)具有潛在的應用前景。

［1]譚濟才，葉恭銀，高旭暉，等.茶樹病蟲防治學［M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：227－229.

［2]謝寶林.茶炭疽病的識別與防治［J].農(nóng)技服務(wù)，2007，24（2）：63.

［3]張志祥，程東美，徐漢虹.生物農(nóng)藥的發(fā)展優(yōu)勢及存在問題［J].世界農(nóng)藥，2004（4）：5－10.

［4]陳百文，劉偉，趙恬歡，等.對茶樹炭疽病菌具拮抗作用的茶樹內(nèi)生細菌的篩選［J].福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2010，39（4）：341－346.

［5]方中達.植病研究方法［M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

［6]江茂生，許文耀.艾蒿提取物對13種植物病原菌物的抑制作用［J].福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2007，36（4）：352－356.

［7]肖琳，金玉蘭.柚皮提取物對植物病原真菌的抑菌活性測定［J].青島農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2010，27（2）：172－175.

［8]焦士蓉，王玲，林玲.蘆柑皮黃酮類物質(zhì)的微波輔助提取及其抗氧化活性研究［J].西華大學學報（自然科學版），2007，26（4）：36－38.

［9]李葉，唐浩國，劉建學.黃酮類化合物的抑菌作用的研究進展［J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學刊），2008（12）：53－55.