鄧荔，閆正，霍永強，郝燕花

（1.河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定 071002； 2.保定市奧科電氣有限公司，河北保定 071002）

實用型簡易激光誘導熒光檢測器的研制及性能測試

鄧荔1，閆正1，霍永強2，郝燕花1

（1.河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定 071002； 2.保定市奧科電氣有限公司，河北保定 071002）

基于正交型結構，研制了一種簡易實用的高效液相色譜激光誘導熒光檢測器。以930熒光光度計為骨架，用島津RF–535熒光檢測池，配以自制可調穩(wěn)壓電源，分別以波長532 nm和405 nm的自制激光器為激發(fā)光源，以羅丹明B和熒光素為熒光試劑評價體系的性能。羅丹明B的檢出限為2.0×10–8mol/L（S/N＞10），熒光素的檢出限為3.0×10–10mol/L（S/N＞10）。測試結果表明該檢測器達到了設計要求，具有足夠的實用靈敏度和較寬的線性范圍。

激光光源；激光誘導熒光；熒光檢測器

激光誘導熒光檢測（LIFD）技術近年來發(fā)展迅速［1］，主要應用在高效液相色譜和毛細管電泳儀的分離檢測上［2–4］。激光具有定向發(fā)光、亮度高、顏色純、能量密度大等特點，相對于傳統(tǒng)光源具有較高的靈敏度，因而LIFD成為痕量環(huán)境和生物樣品檢測的首選技術。

目前，在LIFD中，激發(fā)光源主要以氣體激光器為主，該類激光器存在體積大、能耗大、成本高等缺點，在很大程度上限制了其在LIFD中的應用。半導體激光器具有輸出功率穩(wěn)定、價格低、體積小、壽命長等優(yōu)點，是LIFD比較理想的光源，但目前其輸出波長主要位于紅外及紅光區(qū)，匹配該區(qū)域的熒光物質比較少。近來研究最多的是激光二極管泵浦固體激光器。作為一種新型激光光源，它彌補了傳統(tǒng)激光器的大部分缺點［4–6］，但要做到真正的微型和廉價化，此類激光器仍需研究完善。據(jù)報道利用發(fā)光二極管(LED)作為激發(fā)光源，雖然儀器的微型及廉價化程度大幅提高，但其功率低、光強弱，相對于上述激光器，普通LED光強要降低2～3個數(shù)量級，從而導致熒光靈敏度下降。而且LED為非相干光源，其光束不易聚焦，造成較高的背景和噪聲水平［7］。

筆者以半導體二極管為基本元器件設計和自制激光器，在光源輸出端增加了可調聚焦透鏡裝置，從而保證了較高的輸出能量。將此光源應用于正交光路，在調整好發(fā)射光路的狀態(tài)下，可通過調節(jié)光源進行校正，操作簡便。

1 實驗部分

1.1 儀器裝置

熒光光度計：930型，上海第三分析儀器廠；

檢測池：RF–535熒光池，日本島津公司；

可調穩(wěn)壓電源：1～16 V，自制；

激光器：532，405 nm，自制；

高效液相色譜儀：LC–10A型，蘇州島津公司；

色譜工作站：HW–2000型，上海千譜軟件有限公司；

本檢測體系的基本組成示于圖1。

圖1 檢測器結構示意圖

1.2 試劑

羅丹明B：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

熒光素：分析純，天津市華東試劑廠；

甲醇：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

實驗用水均為三次蒸餾水；

羅丹明B儲備液：1 g/L，用三次蒸餾水配制；

熒光素儲備液：0.1 g/L，用甲醇配制。

1.3 實驗方法

開機后調整高效液相色譜及激光誘導熒光檢測器各參數(shù)，預熱至儀器進入穩(wěn)定狀態(tài)。通過平面六通進樣閥將樣品直接引入檢測器（由于只需測定檢測器的性能指標，所以測試過程中沒有連接色譜柱），記錄檢測器輸出信號（峰高及噪聲）。

2 結果與討論

2.1 正交光路與光源

正交光路是最常見的光學結構，它是指發(fā)射光軸和激發(fā)光軸成直角的光路［8］，其激發(fā)光和發(fā)射光之間的干擾比較小，可得到較好的信噪比。但該結構需要兩套光學系統(tǒng)，校準比較繁瑣［9–10］。本研究所用激發(fā)光源是將可調聚焦透鏡、三維可調支架與光源整體組裝，故裝置體積小、光束密度高。使用時其它部件是固定不動的，只需調節(jié)光源就可校準光路，操作極為簡單。

2.2 聚焦光路對信噪比的影響

調試光路時，將光電轉化裝置、濾光片和檢測池固定在同一直線上。手動調整光源，同時肉眼觀察熒光光斑落在檢測池上的位置和強度情況，然后固定光源。當儀器預熱穩(wěn)定后進樣測定，采集色譜峰高和噪聲，計算信噪比。改變光斑位置后重復進行上述測定。結果表明，激光光斑在檢測池上的聚焦位置對檢測結果的影響較大。圖2給出了激光光斑在檢測池上的3種不同位置。激光光斑落在檢測池正中心位置時（a），并不能得到最強的檢測信號；當激光光斑靠近檢測池上部位置時（b），檢測信號相對減弱；而當激光光斑靠近檢測池下部位置時(c)，檢測信號有所增強。因為在本體系中光源仰射檢測池，這說明檢測信號的大小隨聚焦激光束覆蓋檢測池的面積的增加，照射的熒光分子的數(shù)目增加而變大。因此實驗中可根據(jù)激光色散光斑的位置，選擇激光聚焦斑點靠近檢測池下部的位置收集熒光信號。

圖2 激光色散斑點示意圖

2.3 光源功率對信噪比的影響

一般來講，提高激光激發(fā)功率，熒光信號和背景噪聲都會增強。熒光強度與激光照射功率成正比，背景噪聲則與激光照射功率的平方根成正比，從提高信噪比的角度來講，宜選用功率較大的激光器。另一方面，隨著照射功率的增強又會產(chǎn)生熒光飽和、熒光分子的光解和檢測池熱效應等不利因素［11］。本研究以930熒光光度計為骨架，經(jīng)實驗證實噪聲主要來源于其光電轉換及放大系統(tǒng)，因此，必須綜合考慮上述各種因素的影響。試驗了30，50，100，300 mW的激光光源，結果顯示50 mW及以上功率的光源能滿足實驗的需要。

2.4 基線噪聲及漂移

開機1 h后，測定基線噪聲及漂移1 h。在Y軸滿標量程0.1 mV觀察基線。流動相為0.45 μm濾膜過濾的三次水,流速為1.4 mL/min。測定結果：噪聲為15 μV，漂移為80 μV/h。基線噪聲和漂移譜圖如圖3所示。

圖3 基線噪聲及漂移

2.5 檢測器穩(wěn)定性

分別將10 ng/mL的羅丹明B和1 ng/mL的熒光素溶液連續(xù)進樣11次，考察檢測器穩(wěn)定性。峰高的相對標準偏差分別為4.2%和3.7%，表明該體系穩(wěn)定性良好。

2.6 檢測器的檢出限和線性范圍

分別將羅丹明B溶液和熒光素溶液逐級稀釋至相應的濃度進行色譜分析，得到不同濃度時的檢測響應值，從而確定線性范圍和檢出限。檢出限按信噪比S/N＞10測定，結果見表1。

表1 檢測器的檢出限和線性范圍

3 結論

基于正交型光路，以930熒光光度計為骨架，用島津RF–535熒光檢測器檢測池，配以自制可調穩(wěn)壓電源，以532 nm和405 nm的自制激光器為激發(fā)光源，組裝了一臺激光誘導熒光檢測器。以無柱高效液相色譜儀作為進樣裝置，選用羅丹明B和熒光素評價該體系的性能。結果表明，該體系達到實用靈敏度，線性范圍寬，相對于商用熒光檢測器，該檢測器具有成本低，光學系統(tǒng)結構簡單，易于校準和實用性強等優(yōu)點。若改進光電轉換和放大系統(tǒng)，可得到更好的信噪比。

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Design and Test of Practical and Simple Laser-Induced Fluorescence Detector

Deng Li1， Yan Zheng1， Huo Yongqiang2， Hao Yanhua1
(1.College of Chemistry and Environmental Science， Hebei University， Baoding 071002， China； 2.Baoding Aoke Electric Co.， Ltd.，Baoding 071002， China)

Based on orthogonal structure，a simple laser-induced fl uorescence detector(LIFD) for high performance liquid chromatography(HPLC) was developed. This instrument based on the structure of 930 fl uorescence photometer，with the testing pool of Shimadzu RT–535 and selfmade adjustable stabilized power. Selfmade lasers emitting at 532 nm and 405 nm were used as excitation source. Rhodamine B and fl uorescein were employed for the evaluation of the LIFD system. The concentration detection limit of Rhodamine B and fluorescein were 2.0×10–8mol/L (S/N＞10) and 3.0 ×10–10mol/L (S/N＞10). Test results show that the detector met the design requirements. It had enough practical sensitivity and wide linear range.

laser light source; laser-induced fl uorescence; fl uorescence detector

O657.38

A

1008–6145(2012)03–0080–03

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.022

聯(lián)系人：鄧荔；E-mail: lychee0@yahoo.cn

2012–03–08