潘德鋒 佘菊香 胡春艷

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種敏感、特異、方便快捷的核酸擴(kuò)增技術(shù)。因其無(wú)需特殊設(shè)備，且具有PCR類似的靈敏度和特異性，目前日益受到臨床重視[1]。肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）是一種能引起非典型性肺炎的嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，能導(dǎo)致10%小兒社區(qū)獲得性肺炎[2-3]。由于Cpn分離培養(yǎng)困難，臨床誤診較多。本研究通過(guò)對(duì)比LAMP和最常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）在檢測(cè)小兒Cpn下呼吸道感染情況，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所納入的研究對(duì)象為2010年1月～2012年1月我科收治的80例下呼吸道感染患兒，其中，男性患兒42例，女性患兒38例。年齡2.5～8.5歲，平均年齡（5±0.5）歲。所有患兒均有不同程度的呼吸道感染臨床癥狀，并排除其他肺外感染性疾病。

1.2 Cpn IgM抗體檢測(cè) 入院當(dāng)日空腹抽取靜脈血2mL，抗凝后于1000r離心10min，取200μ L血清用于IgM抗體檢測(cè)。方法按照德國(guó)EuroImmun ELISA試劑盒提供的操作進(jìn)行。根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定的最OD值（λ=450nm）計(jì)算IgM的滴度。

1.3 LAMP實(shí)驗(yàn) 根據(jù)GenBank提供的Cpn基因序列設(shè)計(jì)兩條外引物、兩條內(nèi)引物和兩條環(huán)結(jié)合引物（因涉及專利問題，序列無(wú)法列出）。反應(yīng)體系包括1μL上述3種引物，1.5μL 20×buffer，2.5μLMgCl2，1.25μLdNTP（10mmol/L），5μ L 5×Betaine，Bst多聚酶0.5μL，模板0.5μL，RNA酶0.5μL。反應(yīng)條件為65℃ 45min，結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)LAMP特征性梯狀條帶者為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒下呼吸道Cpn檢出情況 80例患兒分別采用ELISA和LAMP法對(duì)Cpn IgM或DNA進(jìn)行檢測(cè)，從表1可以看出，ELISA法可檢測(cè)出47例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為58.8%，而LAMP法Cpn陽(yáng)性患者為57例，陽(yáng)性率為71.3%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＞0.05。

表1 ELISA與LAMP對(duì)Cpn的檢出情況比較

2.2 服用抗生素對(duì)ELISA和LAMP檢測(cè)Cpn的影響 80例患兒在進(jìn)入我院治療前，有49例曾有抗生素服用史，這些患兒分別經(jīng)ELISA和LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示患兒當(dāng)中，ELISA法檢測(cè)出26例IgM陽(yáng)性（53.1%），而LAMP的檢出率達(dá)75.5%（37/49），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，見表2。

表2 ELISA與LAMP對(duì)已服用抗生素患兒Cpn的檢出影響

3 討論

Cpn是一類嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，也是公認(rèn)最難分離培養(yǎng)的微生物之一，除了血清學(xué)診斷，目前尚無(wú)其他靈敏、簡(jiǎn)便又易于推廣的方法。直接免疫熒光檢測(cè)脫落細(xì)胞中的抗原或者采用微量免疫熒光法檢測(cè)血清中的抗體一向被認(rèn)為是診斷Cpn感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但對(duì)于嬰幼兒來(lái)說(shuō)，此方法實(shí)際可行性較小。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LAMP技術(shù)建立的Cpn檢測(cè)方法，它能在等溫條件下高效地?cái)U(kuò)增DNA，與PCR相比，LAMP受到無(wú)關(guān)DNA的影響較小[4]。在一個(gè)周期為45min的LAMP反應(yīng)體系中，Cpn只需要達(dá)到6個(gè)拷貝的濃度就可被LAMP檢出。此外，由于LAMP是在等溫條件下持續(xù)進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)，因此溫度變化導(dǎo)致的損耗較小，這決定了LAMP效率高的特性。通常情況下，LAMP可在60min內(nèi)將目的基因擴(kuò)增109倍以上。本研究結(jié)果顯示，和目前臨床常用的ELISA相比，LAMP具有較高的檢出率。但本研究顯示兩者并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此在后續(xù)研究當(dāng)中還需要進(jìn)一步增加樣本含量加以分析。

在本研究所納入的患兒當(dāng)中，有49位患兒入院前曾服用過(guò)大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素治療。而對(duì)于這些患者，ELISA僅檢測(cè)出26例陽(yáng)性，而LAMP可檢測(cè)出37例，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明ELISA法與LAMP法相比，雖然總體上對(duì)Cpn的檢出率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但對(duì)于已使用過(guò)抗生素的患兒來(lái)說(shuō)，LAMP顯示出了較好的敏感性。

綜上所述，本研究采用LAMP檢測(cè)小兒下呼吸道Cpn感染，由于其操作簡(jiǎn)單、模板需求量少等優(yōu)點(diǎn)，有望成為核酸擴(kuò)增的重要方法。隨著LAMP技術(shù)的不斷完善和改進(jìn)，LAMP技術(shù)將在病原體診斷方面有更廣闊的發(fā)展前景。

[1]Zhou S,Han S,Shi J,et al.Loop-mediated isothermal amplification for detection of porcine circovirus type 2[J].Virol J,2011,8：497.

[2]曾賽麗,游曉星,劉良專,等.衣原體肺炎患者支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6及IL-10的檢測(cè)及臨床意義[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(34)：15-16.

[3]張荔茗,張英,周細(xì)國(guó).急性毛細(xì)支氣管炎兒童非典型細(xì)菌感染分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(14)：3-4.

[4]Suwanampai T,Pattaragulvanit K,Pattanamahakul P,et al.Evaluation of loop-mediated isothermal amplification method for detecting enterotoxin A gene of Staphylococcus aureus in pork[J]. Southeast Asian J Trop Med Public Health,2011,42(6)：1489-1497.