葉 靜，林 晨，贠江力，古力娜爾·庫(kù)爾班

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，烏魯木齊830011）

子宮頸癌一直是新疆地區(qū)發(fā)病率居首位的婦女惡性腫瘤，尤其維吾爾族婦女子宮頸癌的收治比例明顯高于其他民族，且發(fā)病年齡早，平均年齡為45.04歲（漢族為50.85歲）［1］，晚期患者較多。因此，尋找有助于子宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物是近年來(lái)子宮頸癌研究的熱點(diǎn)之一。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小RNA分子，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA可作為篩查腫瘤的早期診斷指標(biāo)之一［2］。高危型人乳頭瘤病毒（human papilomavirus，HPV）是目前公認(rèn)的子宮頸癌發(fā)生的高危因素之一［3］。而關(guān)于HPV與miRNA之間是否具有相關(guān)性說(shuō)法不一。因此，本研究應(yīng)用鎖定核苷酸原位分子雜交（LNA－ISH）技術(shù)檢測(cè)新疆維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細(xì)胞癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ～Ⅲ級(jí)及慢性宮頸炎中miRNA－101的表達(dá)，并分析子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中miRNA－101與HPV之間的關(guān)系，探討其在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 （1）標(biāo)本來(lái)源：收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2008年6月至2010年6月維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細(xì)胞癌、慢性宮頸炎石蠟標(biāo)本各30例，CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)各15例，均未經(jīng)放療、化療、免疫治療或近期局部物理治療。所有組織均經(jīng)10%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚2μm。本研究中子宮頸癌的高危型HPV數(shù)據(jù)來(lái)自組織標(biāo)本所對(duì)應(yīng)的臨床病歷資料。（2）試劑：miRNA－101探針為Exiqon公司產(chǎn)品；通用型原位雜交檢測(cè)試劑盒Ⅲ MK1031購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；DEPC購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

1.2方法 所有液體試劑均需用0.1%DEPC處理或用DEPC水配置。（1）二甲苯脫石蠟，梯度乙醇脫水；（2）3%H2O2室溫作用10min；（3）胃蛋白酶（成分為1 000μL純凈水、100μL HCl、10μL濃縮胃蛋白酶）37 ℃消化30min，0.5 mol/L TBS洗滌5min×3次；（4）雜交，每張切片20μL雜交液（濃度為1∶200），將原位雜交專用蓋玻片蓋于組織上，切片置于雜交儀內(nèi)，37℃孵育14～16h；（5）37℃2×檸檬酸緩沖液（SSC），5min×2次，洗去部分非特異性結(jié)合的探針；（6）滴加封閉液，37℃孵育20min，甩去多余液體，不洗；（7）滴加堿性磷酸酶標(biāo)記小鼠抗地高辛（用0.5mol/L TBS按1∶200稀釋），37℃孵育60min；（8）BCIP/NBT顯色：按1∶20的比例用0.01mol/L TBS（pH9.5）稀釋，混勻，顯色液加至標(biāo)本上，室溫顯色10min，充分水洗，核固紅復(fù)染5～15min，水洗，水溶性封片劑封片。用已知陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照，用PBS替代miRNA－101抗體作為陰性對(duì)照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

miRNA－101定位于子宮頸上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)著色呈紫藍(lán)色。miRNA－101在慢性宮頸炎中表達(dá)為陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)彌漫性著色呈紫藍(lán)色（封3圖1）；在CINⅠ～Ⅲ級(jí)中miRNA－101陽(yáng)性表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)（封3圖2）；而在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中miRNA－101為陰性表達(dá)，癌巢中未見(jiàn)有藍(lán)紫色的陽(yáng)性表達(dá)顆粒，因有核固紅，故組織呈現(xiàn)紅色（封3圖3）。陰性對(duì)照組全部為陰性。miRNA－101在慢性宮頸炎，CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ及子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.00%（24/30）、73.33%（11/15）、46.67%（7/15）、26.67%（4/15）及10.00%（3/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝36.295，P＝0.000）。在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中 HPV陽(yáng)性率為86.67%（26/30），其miRNA－101表達(dá)與 HPV呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.767，P＝0.000）。在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌高危型HPV陽(yáng)性26例患者中，HPV16檢出率最高，達(dá)73.08%（19/26），明顯高于 HPV18（19.23%）及其他亞型（7.69%）（χ2＝28.500，P＝0.000）。

3 討 論

本課題組在前期研究中用miRNA微陣列芯片，檢測(cè)維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細(xì)胞癌及慢性宮頸炎組織中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)在維吾爾族婦女宮頸癌中有12個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，其中 miRNA－101下調(diào)最明顯，并用RT－PCR方法驗(yàn)證了芯片檢測(cè)結(jié)果［4］。miRNA－101是一類單鏈核糖核酸的負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA。miRNA－101前體是一個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大約有70個(gè)核苷酸，在Dicer的作用下，剪切為21～24個(gè)核苷酸的成熟miRNA－101。在多種腫瘤中miRNA－101的表達(dá)下調(diào)，如胃癌［5］、結(jié)腸癌［6］、前列腺癌［7］、非小細(xì)胞肺癌［8］、肝細(xì)胞性肝癌［9］等。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－101在慢性宮頸炎上皮組織中陽(yáng)性率最高，在CINⅠ～Ⅲ級(jí)中表達(dá)呈階梯樣下降，而在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中陽(yáng)性率最低，即在子宮頸由癌前病變發(fā)展到子宮頸癌的過(guò)程中miRNA－101表達(dá)逐步降低。這與國(guó)外大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相一致，提示miRNA－101的表達(dá)失調(diào)可能與子宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。Hiroki等［10］在miRNA與子宮內(nèi)膜漿液性腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA－101表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miRNA－101或前體miRNA－101到子宮內(nèi)膜漿液性腺癌的細(xì)胞株中，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制。Friedman等［11］對(duì)膀胱移形細(xì)胞癌中miRNA－101的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miRNA－101抑制膀胱移形癌細(xì)胞株中的細(xì)胞增殖和集落形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－101在CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)中均有表達(dá)，且其陽(yáng)性率呈階梯樣下降，即miRNA－101在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌前病變階段隨著病情發(fā)展其陽(yáng)性率逐步下降，提示miRNA－101有可能成為新的檢測(cè)宮頸癌的早期指標(biāo)之一。這與以往文獻(xiàn)報(bào)道相似。Hanke等［2］研究發(fā)現(xiàn)miRNA－152可能用于膀胱癌的無(wú)創(chuàng)性早期診斷；血清標(biāo)本中的miRNA－21也可作為彌散性巨大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）非損傷性的診斷標(biāo)記物［12］，而痰液miRNA－21水平診斷法可能成為一種有效的肺癌無(wú)創(chuàng)傷檢查法［13］。

本研究通過(guò)對(duì)維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細(xì)胞癌臨床病例中高危型HPV數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)高危型HPV陽(yáng)性的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中miRNA－101低表達(dá)，在慢性宮頸炎上皮組織中miRNA－101高表達(dá)。即在高危型HPV陽(yáng)性的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌組織與正常宮頸組織中miRNA－101差異表達(dá)，提示miRNA－101表達(dá)改變可能與HPV陽(yáng)性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系。本研究中，高危型HPV陽(yáng)性為26例，其中，HPV16檢出率最高（73.08%），明顯高于 HPV18及其他亞型，提示維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細(xì)胞癌高危型HPV感染以HPV16為主。而關(guān)于miRNA與HPV是否在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起相互作用，國(guó)內(nèi)、外研究者的看法不一。Melar－New等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，高水平的 miRNA－203抑制高危型HPV的擴(kuò)增，而高危型HPV病毒蛋白也能夠抑制分化細(xì)胞中miRNA－203的表達(dá)。與此相反，Cai等［15］對(duì) HPV31型復(fù)制周期的潛伏期和繁殖期進(jìn)行miRNAs分析，發(fā)現(xiàn)的500余種細(xì)胞miRNAs中沒(méi)有一個(gè)HPV31特異的miRNAs，他們認(rèn)為HPV31及所有亞型的HPV均不表達(dá)病毒編碼的miRNAs。造成這種截然相反結(jié)果的原因可能包括：（1）研究對(duì)象的異質(zhì)性。不同的子宮頸癌組織構(gòu)成（如組織學(xué)類型、病理分期、臨床分級(jí)）和正常對(duì)照宮頸組織來(lái)源，均可能導(dǎo)致結(jié)論不一致。（2）采用不同的篩選方法及定量方法可能導(dǎo)致結(jié)果差異。因此，有必要進(jìn)行大樣本、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化的子宮頸癌 miRNA－101表達(dá)譜研究，以明確miRNA－101的表達(dá)變化與HPV陽(yáng)性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌之間的相關(guān)性。所以，探討高危型HPV感染及致癌過(guò)程中miRNA－101的表達(dá)特征及作用機(jī)制，對(duì)闡明HPV致癌機(jī)制和探索阻斷宮頸癌發(fā)生的新策略和新靶點(diǎn)具有極其重要的意義。

綜上所述，miRNA－101參與了維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展；miRNA－101與高危型 HPV感染有關(guān)；miRNA－101可能作為子宮頸癌篩查以及早期診斷的分子指標(biāo)。高危型HPV與miRNA－101在子宮頸癌中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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