呂敏娜，戚南山，覃宗華，廖申權(quán)，余勁術(shù)，袁建豐，吳彩艷，孫銘飛＊

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東 廣州 510640；2.廣州英賽特生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起雛鴨的一種高度致死性、傳播迅速的病毒性傳染病[1]。我國于1963年在上海首次報道了該病的臨床病例，1980年在北京某鴨場分離到該病毒[2]，郭玉璞等于1984年將該病毒確定了DHV－1[3]。鴨病毒性肝炎臨床表現(xiàn)痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，以發(fā)病急、傳播快、病死率高為主要特征，病理變化以肝臟腫脹和出血為特征性病變[4－5]。Ⅰ型鴨病毒性肝炎呈世界性流行，也是我國主要流行的血清型，此病不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展，而且造成的經(jīng)濟損失也相當(dāng)嚴(yán)重。

DHV編碼含2249個氨基酸的一個多聚蛋白[6]，經(jīng)過一系列蛋白裂解，產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白（VP0、VP3、VP1）和8個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D）[7－9]。其中，VP1含有多個抗原表位，不僅能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，還能誘導(dǎo)感染動物產(chǎn)生中和抗體，VP1包含了大多數(shù)與細(xì)胞受體相互作用和中和表位[10－13]。因此，VP1 與DHV的致病性關(guān)系密切，作為研制新型疫苗的候選分子而成為近年來的研究熱點。

本研究將擴增的DHV－I VP1基因定向克隆到原核表達(dá)載體pMAL－C2X中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL－C2X－VP1，利用IPTG 誘導(dǎo)在 E.coli BL21（DE3）進(jìn)行融合表達(dá)，為DHV－I VP1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能等后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試驗材料 Ⅰ型鴨肝炎病毒（DHV－I）GD株為廣東省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所分離、保存；E.coli DH5a、BL21（DE3）購自 Novagen公司；pGEMT easy、RNA提取試劑盒、RT－PCR試劑盒購自Promega公司；DNA膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、DNA Marker DL 2000購自寶生物工程（大連）有限公司；pMALC2X為美國德克薩斯州A和M大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院朱冠博士惠贈。

1.1.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的Ⅰ型鴨肝炎病毒核甘酸序列，設(shè)計了針對VP1基因片段的引物，在上游引物引入EcoRⅠ酶切位點，下游引物中引入HindⅢ酶切位點，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：

上游引物：5′－GGTGGTGAATTCGGTGATTCCAATCAGTTAGG－3′；下游引物：5′－GGTGGTAAGCTTTCATTCAATTTCCAAATTGAG－3′。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 取經(jīng)DHV－1GD株強毒感染的病死雛鴨的肝臟，采用RNA提取試劑盒進(jìn)行DHV－1GD株總RNA抽提，操作參照說明書。

1.2.2 DHV－1VP1基因的擴增和測序根據(jù)Promega公司的RT－PCR試劑盒操作說明設(shè)置RT－PCR反應(yīng)體系，并按以下程序進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)：反轉(zhuǎn)錄合成（48℃45min）→第二鏈合成（94℃2min）→30個循環(huán)（94℃變性30s，54.8℃退火1min，68℃延伸2min）→68℃延伸7min→4℃終止反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段，并將其與克隆載體pGEM－T easy連接后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪于SOB平板（含100μg／mL氨芐青霉素）于37℃過夜培養(yǎng)。用藍(lán)白斑篩選方法挑取白色菌落用LB培養(yǎng)基（含100μg／mL氨芐青霉素，以下同）培養(yǎng)后，用菌液PCR法和限制性酶切法對轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)行鑒定，陽性克隆命名為pGEM－VP1，并送上海英駿生物工程公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 取E.coli（pMAL－C2X）新鮮單菌落接種于10mL LB液體培養(yǎng)基中（Amp＋），37℃振蕩培養(yǎng)16h后，用小量質(zhì)粒制備試劑盒抽提質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對所抽提的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA膠回收試劑盒回收酶切后的質(zhì)粒片段。將分別經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后回收純化的 DHV－1VP1和pMAL－C2X在T4DNA連接酶作用下連接后用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，利用藍(lán)白斑篩選方法挑取白色菌落用LB液體培養(yǎng)基（Amp＋）培養(yǎng)后，用菌液PCR法篩選陽性克隆菌，再經(jīng)EcoRⅠ 和HindⅢ雙酶切鑒定后，將陽性克隆菌送上海英駿公司進(jìn)行重組質(zhì)粒核苷酸序列測序，再用質(zhì)粒小量制備試劑盒提取陽性質(zhì)粒，此重組質(zhì)粒命名為pMALC2X－VP1。

1.2.4 重組表達(dá) 將重組質(zhì)粒pMAL－C2X－VP1用CaCl2法轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）。陽性菌落鑒定后命名為 BL21／pMAL－C2X－VP1。挑取BL21／pMAL－C2X－VP1單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中（Amp＋），37 ℃、200r／min搖床過夜培養(yǎng)，隔天以1%的接種量轉(zhuǎn)接至50mL LB液體培養(yǎng)基中（Amp＋），于37℃、200r／min搖床培養(yǎng)至OD600約為0.6，取1mL未誘導(dǎo)培養(yǎng)物，10000r／min離心1min，收集菌體，加適量1×SDS凝膠加樣緩沖液重懸菌體，100℃煮沸3min。余下的培養(yǎng)物加入IPTG（使其終濃度為1mmol／L），于37℃誘導(dǎo)1、2、4h，取1mL培養(yǎng)物如前述步驟處理，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，觀察誘導(dǎo)后不同時間外源基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 DHV－1VP1基因的克隆與鑒定

用Ⅰ型鴨肝炎病毒GD株RNA為模板，用設(shè)計的引物經(jīng)RT－PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂凝膠電泳后，得到一條約為750bp的目的條帶（圖1）。測序結(jié)果表明，擴增的VP1基因與預(yù)期相符，由714個核甘酸組成，編碼237個氨基酸。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

DHV－1VP1基因片段經(jīng)回收純化后，與克隆載體pGEM－T easy連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，得到的重組質(zhì)粒pGEM－VP1，經(jīng)PCR鑒定，在約714bp處有一條目的條帶（圖1）。

圖1 VP1PCR擴增結(jié)果Fig.1 The PCR results of VP1

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pMAL－C2X－VP1用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），陽性克隆菌抽提質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，可見大小與空載體和VP1片段大小一致的2個條帶，前者與線性化pMAL－C2X大小相近，而后者與DHV－1GD株VP1的PCR產(chǎn)物大小一致（圖2）。

圖2 pMAL－C2X－VP1酶切鑒定Fig.2 Identification of pMAL－C2X－VP1 by restriction enzyme digestion

2.4 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS－PAGE檢測

重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL－C2X－VP1鑒定正確后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物，在誘導(dǎo)表達(dá)后的1、2、4h取樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳分析，結(jié)果表明，在誘導(dǎo)1h時已開始表達(dá)，融合蛋白的分子質(zhì)量大約69ku（圖3）。

圖3 VP1蛋白在大腸埃希菌BL21（DE3）中的表達(dá)Fig.3 SDS－PAGE analysis of VP1protein expression in BL21（DE3）

3 討論

Ⅰ型鴨肝炎病毒屬小RNA病毒科，基因組為單股正鏈RNA，全長為7707bp～7713bp，內(nèi)含一個編碼2249個氨基酸多聚蛋白的開放閱讀框（ORF）。結(jié)構(gòu)蛋白 VP1位于 DHV－1基因組的2103位～2816位，VPl全基因由714個核苷酸組成，編碼238個氨基酸[14]。然而，目前對 DHV－1 VP1蛋白的研究不多，其結(jié)構(gòu)和功能未明確，因此與VP1蛋白相關(guān)的研究不僅具有重要的理論意義，而且對于應(yīng)用也具有廣泛的指導(dǎo)價值。

本研究利用RT－PCR技術(shù)獲得Ⅰ型鴨肝炎病毒的VP1基因，并用pMAL－C2X表達(dá)載體成功表達(dá)了DHV－1結(jié)構(gòu)蛋白VP1，利用序列分析表明，所克隆的VP1基因長度為714bp，編碼237個氨基酸，原核表達(dá)產(chǎn)物大小約為69ku。這為深入研究VPl蛋白的結(jié)構(gòu)與功能及研制DHV－1的新型疫苗與診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

一直以來，Ⅰ型鴨病毒性肝炎的流行給我國的養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的損失和嚴(yán)重的威脅。隨著DHV－1全基因組序列的發(fā)表和分子生物學(xué)技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，進(jìn)一步將基因工程技術(shù)表達(dá)的抗原或是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段抗原運用到免疫學(xué)檢測方法中，達(dá)到高特異性、高敏感性的效果是今后的研究方向。

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