韓秀杰，張保新，趙凡凡，余風艷，沈紅霞，王曉杜

（浙江農(nóng)林大學動物科技學院，浙江 臨安 311300）

日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），又稱乙型腦炎病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬單股正鏈RNA病毒，它可引起以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的蟲媒性人畜共患病，即日本腦炎或乙型腦炎[1]。每年在全球有30000～50000個乙型腦炎病例，其中超過10000人死亡，乙型腦炎廣泛分布于東南亞各地區(qū)，而我國是乙型腦炎發(fā)病人數(shù)最多的國家之一，占世界總發(fā)病數(shù)的80%以上[2]，幸存者約有一半留有嚴重的神經(jīng)和精神后遺癥。而在動物中豬是JEV的主要感染對象和寄存宿主，種豬感染JEV后表現(xiàn)為繁殖機能障礙，母豬表現(xiàn)為產(chǎn)死胎、木乃伊胎等。該病的發(fā)生既嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展，同時也對公共衛(wèi)生具有重要的影響。

JEV的基因組為單股、正鏈RNA分子，其長度約為11kb（10976bp），裸露的病毒RNA有感染性。在宿主和病毒蛋白酶的切割下，JEV產(chǎn)生3種結(jié)構蛋白，即C蛋白（殼／核心蛋白）、PrM／M（膜前體蛋白／膜蛋白）和E蛋白（囊膜糖蛋白）以及7種非結(jié)構白，即 NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5[3]。自從該病毒產(chǎn)生以來，進化出5種基因型，逐漸遍布整個亞洲[4]。

JEV NS3基因全長約1850bp，編碼蛋白的分子質(zhì)量為64ku。它是一個具有絲氨酸蛋白酶、螺旋酶、核苷酸5′磷酸酶的活性蛋白質(zhì)，在病毒前體蛋白剪切和基因組RNA復制中具有重要作用[5]。有研究表明NS2B－NS3蛋白酶復合物的形成，有利于C－prM前體的剪切加工，并使C和prM分泌增加[6]。在JEV感染細胞中，NS3與微管和腫瘤敏感基因101蛋白密切相關，在病毒的RNA裝配、病毒成分胞內(nèi)運輸以及病毒的裝配中發(fā)揮重要作用[7－9]。NS3主要定位在JEV誘導的膜泡上，該膜泡是病毒成分貯存主要場所，NS3蛋白有利于病毒的裝配。Chen C J等[10]。研究表明，NS3和NS5在體內(nèi)相互作用形成蛋白復合物，繼而與3′端非編碼區(qū)的莖環(huán)結(jié)構形成復制復合體，參與負鏈RNA的合成。因此，NS3蛋白可能是一個潛在的藥物靶標分子，在抗JEV病毒藥物開發(fā)方面具有重要作用[9]。

本研究擬克隆豬日本腦炎病毒的NS3基因，構建重組原核表達載體，在大腸埃希菌中大量表達，并純化該重組蛋白，鑒定其免疫學活性，為探討該蛋白的功能及病毒復制的相關研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

豬日本腦炎病毒SH－JEV01毒株由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所馬志永研究員惠贈；BHK－21細胞原核表達載體pET－28（a）、大腸埃希菌感受態(tài)細胞、DH5α和BL21（DE3）由浙江農(nóng)林大學獸醫(yī)微生物學實驗室保存。

DNA Marker DL 2000，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ，AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taq DNA聚合酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；T4DNA ligase購自 NEB公司；異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司；Trizol購自invitrogen公司；UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，A型小量DNA片段快速純化回收試劑盒購于北京博大泰克基因技術有限公司；質(zhì)粒DNA小量試劑盒購自上海華舜生物公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組RNA的提取 將JEV感染的BHK－21細胞樣品重懸于 Trizol試劑中，室溫10min后，加入1／3體積的氯仿，反復混勻后室溫5min。以15000r／min離心15min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積的異丙醇，反復混勻后室溫沉淀5min，以15000r／min離心15min。去掉上清后，用700ml／L乙醇洗滌沉淀1次，室溫干燥后，溶于適量的RNase free水中，置－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT－PCR 擴增JEV NS3基因 根據(jù) AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的方法，將上面提取的病毒基因組RNA，利用隨機引物擴增下合成cDNA。以此cDNA 為模板，引物 F：5′GCGGAATTCATGGGGGGCGTGTTTG 3′；R：5′GCGGTCGACTTATCTCTTCCCTGCT 3′，在PCR管中加入如下20μL體系：RNA se Free ddH2O，14.3μL；10 ×buffer 2μL；dNTPs 1.6μL；10μmol／L 引物各0.4μL；Taq酶0.3μL；cDNA模板1μL。在PCR儀中以下面條件進行PCR擴增：94℃5min；94℃50s，58℃50s，72℃2min，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃10min，最后4℃終止反應。10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.3 pET－28（a）－JEV－NS3重組質(zhì)粒構建 將上述膠回收的JEV－NS3的PCR產(chǎn)物和pET－28（a）空載體分別用EcoRⅠ、SalⅠ酶進行雙酶切，酶切回收后，在T4連接酶作用下，把JEV－NS3亞克隆到pET－28（a）質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH5α，挑取克隆經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性者，送上海英駿生物公司測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白JEV－NS3的誘導表達 將上述鑒定好的陽性重組質(zhì)粒pET－28（a）－JEV－NS3轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）內(nèi)，挑取克隆擴大培養(yǎng)，細菌生長到對數(shù)期時加入1mmol／L的IPTG，誘導3h后，取樣并煮沸制備樣品，SDS－PAGE電泳檢測重組JEV NS3蛋白表達情況。

1.2.5 重組JEV NS3蛋白的包涵體提取與純化將1.2.4鑒定好的表達JEV NS3蛋白的陽性克隆擴大到100mL進行培養(yǎng)，當細菌生長到對數(shù)期時，加入1mmol／L的IPTG，誘導表達3h后，收集菌體，按照王曉杜等[11]方法提取包涵體，并對溶解的包涵體進行復性，透析后制備大量可溶性的重組JEV NS3蛋白。SDS－PAGE檢測該蛋白包涵體提取和復性效果。

2 結(jié)果

2.1 JEV NS3基因RT－PCR 結(jié)果

以JEV的cDNA為模板，RT－PCR擴增JEV NS3的基因片段，在該片段前面加上起始密碼子ATG和后面加上終止密碼子TAA，引物兩端分別加有EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小1.8kb左右的片段，與預期大小基本一致（圖1）。

圖1 JEV－NS3基因的RT－PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of JEV NS3gene by RT－PCR

2.2 重組質(zhì)粒pET－28（a）－JEV NS3的構建

JEV NS3基因的PCR產(chǎn)物、pET－28（a）空載體分別用EcoRⅠ、SalⅠ酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒再進一步用EcoRⅠ、SalⅠ酶進行雙酶切鑒定（圖2），結(jié)果為陽性的克隆送生物公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI上Blast比對表明，本研究克隆到了JEV NS3基因，該片段與NCBI上公布的序列（GenBank No：AF069076）同源性高達97%。

圖2 pET－28（a）－JEV－NS3重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET－28（a）－JEV NS3by restrict enzyme digestion

2.3 重組JEV－NS3蛋白的誘導表達

上述鑒定好的陽性pET－28（a）－JEV NS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），挑取克隆擴大培養(yǎng)3h后，1mmol／L IPTG誘導3h，分別在誘導前和誘導后取樣，煮沸裂解細菌，SDS－PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況。結(jié)果表明重組蛋白JEV NS3在大腸埃希菌內(nèi)大量表達（圖3），分子質(zhì)量為64ku，與預期大小一致。薄層掃描分析表明，表達的重組蛋白占總菌體蛋白的30%以上。

2.4 重組JEV NS3蛋白的包涵體提取和純化

為了獲得高純度的重組JEV NS3蛋白，把上述鑒定能表達重組蛋白的克隆擴大培養(yǎng)到100mL，收集菌體后，利用溶菌酶裂解和超聲破碎菌體，高速離心收集沉淀，沉淀用脫氧膽酸鈉處理后，變性劑十二烷基肌氨酸鈉溶解包涵體，然后利用還原型和氧化型谷胱甘肽復性重組蛋白，透析除去變性劑后，PEG濃縮蛋白。在每一個步驟取樣，SDS－PAGE檢測純化效果。結(jié)果表明，重組蛋白主要在包涵體中，上清中沒有表達，純化后檢測發(fā)現(xiàn)該方法獲得較好的純化效果，薄層掃描分析表明，純化后重組蛋白占總蛋白的70%以上（圖4）。

圖3 重組JEV NS3蛋白的誘導表達Fig.3 Expression of recombinant protein JEV NS3by IPTG induction

圖4 重組JEV NS3蛋白包涵體的提取和純化效果檢測Fig.4 Extraction and purification of recombinant protein JEV NS3inclusion body

3 討論

豬是JEV的天然宿主之一，病毒能在豬群中大量繁殖，經(jīng)蚊蟲再傳播給人，所以控制該病在豬群中的發(fā)生具有重要的公共衛(wèi)生學意義。除此之外，JEV引起的母豬繁殖障礙給養(yǎng)豬業(yè)也帶來了重大危害，監(jiān)測該病的流行情況，控制其在豬群中的擴散，研發(fā)抗病毒藥物等措施都有利于該病的防控。

NS3蛋白在病毒RNA的復制和病毒包裝等方面具有十分重要的功能，同時NS3蛋白在誘導宿主免疫應答和致病性方面也具有重要作用。它是誘導細胞免疫應答的主要抗原之一[12]，同時也能激活胞內(nèi)凋亡相關蛋白活性，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[13]。本研究克隆了從豬群中分離的神經(jīng)毒JEV病毒株的NS3基因，該序列與NCBI上公布序列同源性97%以上，在原核表達系統(tǒng)中大量表達重組蛋白JEV NS3，表達量達到菌體總蛋白的30%以上，純化后重組蛋白能占到總蛋白的70%以上。本研究利用前人的方法[11]獲得較純的NS3重組蛋白，為制備該蛋白的抗體，研究其病毒誘導的細胞免疫中作用和探討其在病毒致病中的機理奠定了較好的基礎。

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