王啟宇，蘭鄒然，姜 平，張 月，劉 娟

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 濟(jì)南 250022；3.山東師范大學(xué)體育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒引起的豬的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病[1]，臨床主要以稽留高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點(diǎn)為特征。豬瘟病毒有C、Erns（E0）、E1和E2四種結(jié)構(gòu)蛋白，其中E2蛋白是最主要的保護(hù)性抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，并使機(jī)體抵抗致死量強(qiáng)毒的攻擊；其基因總長度為1119bp，編碼約370個(gè)氨基酸，始于豬瘟病毒多聚蛋白690位氨基酸殘基，終止于1060位氨基酸殘基，約為370個(gè)氨基酸，其N端上游有一段信號(hào)肽序列，C端有一段疏水性的跨膜區(qū)（TMR），并且E2蛋白具有兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)單位，一個(gè)由B和C區(qū)組成，另一個(gè)由高度保守的A和D區(qū)組成，是產(chǎn)生中和抗體的主要區(qū)域[2]。豬瘟兔化弱毒疫苗株曾經(jīng)有效地控制了豬瘟的發(fā)生和流行，但是近年來豬瘟免疫失敗的現(xiàn)象很多，而且研究表明，許多地區(qū)豬瘟病毒流行毒株已向遠(yuǎn)離疫苗株的方向演變[3－6]，盡管豬瘟疫苗的有效性未被質(zhì)疑，但是針對(duì)現(xiàn)階段流行毒株研制相應(yīng)的豬瘟疫苗作為技術(shù)儲(chǔ)備已成為科技工作者的選擇方向，其中亞單位疫苗以其特有的安全性倍受關(guān)注，并成為豬瘟新型疫苗研究的熱點(diǎn)。

本研究構(gòu)建了去跨膜區(qū)E2基因的畢赤酵母真核表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化整合到酵母X－33細(xì)胞基因組中，經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS－PAGE和 Western Blot鑒定，證明在酵母培養(yǎng)上清中，E2蛋白獲得成功表達(dá)，為豬瘟亞單位疫苗和抗E2蛋白抗體診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 酵母表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母X－33菌株、重組質(zhì)粒pMD18－T－E2由山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心提供。

1.1.2 試劑 pGEM－T克隆載體購自Promega公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、Zeocin（新霉素）購自TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豬IgG、HRP－DAB底物顯色試劑盒、三氯乙酸（TCA）購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；YPD、YPDS、BMMY、BMGY培養(yǎng)基均按Easy selectTMpichia expression kit方法配制。

1.1.3 豬瘟陽性血清 豬瘟陽性血清由山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心提供。

1.1.4 引物 參照已發(fā)表的Shimen毒株（AF092448）的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1、P2，用于E2基因的擴(kuò)增，P1：5′－CCGGAATTCCGGCTAGCCTGTAAGGAAG－3′；P25′－ATTTGCGGCCGCGTCAGTCACGTCCAGGTCAA－3′，其中加下劃線的序列分別是限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ的識(shí)別序列；并合成用于測(cè)序和鑒定外源基因整合至酵母基因組的引物5′AOX1：5′－GACTGGTTCCAATTGACAAGC－3′；3′ AOX1：5′－GGCAAATGGCATTCTGACATCCT－3′；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 去跨膜區(qū)E2基因的擴(kuò)增 以重組質(zhì)粒pMD18－T－E2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：無菌去離子水14.88μL，10×PCR buffer 2.0μL，dNTPmix 1.6μL，P10.2μL，P20.2μL，ExTaq DNA聚合酶0.12μL，質(zhì)粒模板1.0μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性7min；94℃30s，62℃30s，72℃1 min，共34個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸7min。之后將PCR產(chǎn)物在10g／L的瓊脂糖凝膠電泳中觀察結(jié)果，用膠回收試劑盒回收。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[7]方法將PCR產(chǎn)物連入pGEM－T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α中，提取重組質(zhì)粒pGEM－T－E2，經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切定向插入P.pichia表達(dá)載體pPICZαA中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA－E2。

1.2.3 pPICZαA－E2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌及高拷貝整合菌株的篩選 參照Easy selectTMpichia expression kit的說明用SacⅠ單酶切線化pPICZαA－E2表達(dá)質(zhì)粒10μL轉(zhuǎn)入80μL酵母X－33感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻，在0.2cm的石英電轉(zhuǎn)杯中，以1.5kV、20μF、200Ω的條件進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，涂Zeo－YPDS平板，后將陽性轉(zhuǎn)化子依次接種至含高濃度的ZeocinTM素的YPDS選擇平板，以在高濃度ZeocinTM素上正常生長的菌落為高拷貝整合菌株。

1.2.4 酵母基因組PCR鑒定 在高濃度ZeocinTM素下培養(yǎng)72h的酵母培養(yǎng)物的基因組提取參照文獻(xiàn)[8]，用煮沸－凍融－煮沸法進(jìn)行。取上清為模板，用引物5′AOX1、3′AOX1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定整合至酵母基因組中的目的基因。

1.2.5 陽性轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá) 參照Easy selectTMpichia expression kit的說明選3個(gè)～5個(gè)PCR陽性菌株在30℃條件下進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，分別于24、48、72、96h取培養(yǎng)物1.5mL于離心管中12000r／min離心10min，分別收集上清，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE和 Western blot鑒定 取上清1mL，以1∶10比例加入100%TCA進(jìn)行濃縮，上樣進(jìn)行SDS－PAGE，隨后進(jìn)行半干轉(zhuǎn)印，用豬瘟陽性血清進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增和克隆質(zhì)粒pGEM－T－E2的酶切鑒定

PCR產(chǎn)物在10g／L的瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)999bp的特異性條帶，與預(yù)期分子質(zhì)量一致（圖1），經(jīng)過測(cè)序證明所擴(kuò)增的序列為豬瘟病毒E2基因；克隆質(zhì)粒pGEM－T－E2在經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)3000bp和999bp的特異性條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplifying the E2gene by PCR

圖2 重組質(zhì)粒pGEM－T－E2的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 The identification result of recombinant plasmid pGEM－T－E2 digested by restricted enzymes

2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA－E2雙酶切鑒定結(jié)果

重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA－E2經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)3600bp和999 bp的特異性條帶（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 重組質(zhì)粒pPICZαA－E2的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 The identification results of recombinant plasmid pPICZαA－E2 digested by restricted enzymes

2.3 酵母基因組PCR鑒定目的基因的整合結(jié)果

重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ線性化后電轉(zhuǎn)入酵母X－33，涂布含Zeocin的YPDS平板，28℃～30℃培養(yǎng)3 d～5d出現(xiàn)菌落，并在1000μg／mL Zeocin的YPDS板上共獲得3個(gè)陽性高拷貝轉(zhuǎn)化子。提取其基因組，以5′AOX1、3′AOX1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，出現(xiàn)2200bp和1500bp的條帶，證明篩選的轉(zhuǎn)化子是高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子（圖4）。

圖4 重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增Fig.4 Amplification of Pichia yeast transformant by PCR

2.4 表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE和Western blot鑒定

誘導(dǎo)24h、48h樣品經(jīng)SDS－PAGE電泳不見條帶，而誘導(dǎo)72h后樣品經(jīng)SDS－PAGE出現(xiàn)特異性電泳條帶（圖5），大小為52ku，與預(yù)期推導(dǎo)分子質(zhì)量相符，在Western blot結(jié)果中有明顯的雜交帶而對(duì)照組雜交呈陰性（圖6），說明酵母培養(yǎng)上清中E2蛋白成功獲得表達(dá)，且與豬瘟抗血清有良好的特異性反應(yīng)能力。

圖5 SDS－PAGE鑒定 X－33－pPICZαA－E2蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 Identification of expressed protein of pPICZαA－E2 in X－33by SDS－PAGE

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant protein

3 討論

原核生物作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)有其自身特有的優(yōu)點(diǎn)，即產(chǎn)量高、生長速度快、操作容易、成本低，但也存在著一些缺陷，比如不能對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化等翻譯后修飾，特別是對(duì)真核基因的表達(dá)，可能導(dǎo)致產(chǎn)物失去生物活性，而酵母作為一種簡單的單細(xì)胞真核生物，兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點(diǎn)，它可對(duì)異源蛋白進(jìn)行修飾，選用帶有信號(hào)肽的質(zhì)粒時(shí)，蛋白能被正確折疊和加工，然后分泌到培養(yǎng)基中；與哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母可以在簡單培養(yǎng)基中生長，加之酵母本身分泌的背景蛋白少、易進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)，擴(kuò)大產(chǎn)量，因此我們選用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)E2蛋白進(jìn)行表達(dá)，有利于后續(xù)亞單位疫苗的研究和診斷試劑的研制。

本研究使用的載體pPICZαA含有α信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白通過核糖體－內(nèi)質(zhì)網(wǎng)－高爾基體途徑分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，在分泌過程中，會(huì)進(jìn)行糖基化修飾，而E2蛋白具有5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)[9]，此表達(dá)系統(tǒng)使表達(dá)出的E2蛋白具有天然的構(gòu)象，同時(shí)在引物設(shè)計(jì)時(shí)去除了E2基因C端的TMR，這樣更有利于E2蛋白進(jìn)行分泌表達(dá)。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體能夠通過電轉(zhuǎn)化的形式將質(zhì)粒整合到酵母基因組的特定位點(diǎn)，此研究利用SacⅠ作用于AOX1，電轉(zhuǎn)化入酵母基因組中，以單交換的方式整合到X－33的基因組中，產(chǎn)生Mut＋型表型，同時(shí)由于目的基因的高拷貝數(shù)與抗性有一定的正相關(guān)性[10]，所以我們利用高抗性的Zeocin進(jìn)行篩選，選擇出具有高拷貝數(shù)的重組子，而拷貝數(shù)的多少與蛋白表達(dá)的數(shù)量也呈一定的正相關(guān)性[11]；當(dāng)然表達(dá)量的多少還與很多其他因素有關(guān)，比如溫度、pH、甲醇的添加量以及密碼子偏好性等等[12]。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)因其表達(dá)外源基因的優(yōu)越性而得到廣泛應(yīng)用，它已高效分泌表達(dá)了乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、腫瘤壞死因子（TNF）、表皮生長因子（EGF）、人血清白蛋白、水蛭素、蛋白酶抑制劑、膜蛋白、基因工程抗體等，但此系統(tǒng)還需進(jìn)一步完善，比如與大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)相比，其耗時(shí)時(shí)間長，存在蛋白質(zhì)的降解等等一些不可避免的問題，但我們相信隨著該系統(tǒng)基礎(chǔ)研究的深入和應(yīng)用研究的推廣，其在病原生物學(xué)領(lǐng)域?qū)⒌玫皆絹碓綇V泛的應(yīng)用。

總之，豬瘟E2蛋白在畢赤酵母中的成功表達(dá)，為開展豬瘟亞單位疫苗研究做了必要的準(zhǔn)備。

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