臧瑩安，黃彩梅，李婉雁，李 淼，宋 帥，李春玲＊

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科學(xué)系，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東 廣州 510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

副豬嗜血桿菌（HPS）一般條件下難以分離和培養(yǎng)，尤其是應(yīng)用抗生素治療過病豬的病料，因而給副豬嗜血桿菌病的診斷帶來困難。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有操作簡單、反應(yīng)速度快、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，很適合應(yīng)用于實(shí)踐。國內(nèi)外采用ELISA對HPS進(jìn)行檢測研究的為數(shù)不少，但都以全菌研究為主，尚未見有針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5（OMP P5）的間接ELISA抗體檢測方法。且操作過程中加樣作用時間也不盡相同，其中以30、60、120min居多。對酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的選擇也各有差異，其中以30min和60min為反應(yīng)時間的較多[1－2]。造成檢測操作時間過長，結(jié)果不夠穩(wěn)定，差異較大。目前，尚未找到一種理想的ELISA抗體檢測方法。

外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）是副豬嗜血桿菌的主要毒力因子之一[3]，是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，占其全部組成的一半，在維持外膜結(jié)構(gòu)，保證物質(zhì)運(yùn)輸，作為大腸菌素、噬菌體受體以及參與F因子結(jié)合等方面均有重要的作用。許多致病菌的OMP具有良好的免疫原性，可同時激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，具有異種血清型的免疫交叉保護(hù)作用，是一種潛在的共同保護(hù)性抗原[4]。研究結(jié)果顯示，OMP P5蛋白具有豐富的二級結(jié)構(gòu)，其β2轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域可能形成抗原表位。OMP P5蛋白無跨膜區(qū)，提示該蛋白可能實(shí)現(xiàn)較高量及可溶性的表達(dá)。HPS OMP P5很有可能成為檢測或診斷副豬嗜血桿菌病的候選抗原，作為一種臨床上診斷HPS的新手段[5]。

本研究將重組表達(dá)純化的副豬嗜血桿菌P5蛋白（OMP P5）作為包被抗原，對已有間接ELISA抗體檢測方法的最佳封閉條件、最佳加樣作用時間、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化探索。應(yīng)用優(yōu)化后的方法對進(jìn)行和未進(jìn)行HPS免疫的健康豬的血清樣品進(jìn)行檢測，以考察該方法的可靠性，進(jìn)一步對豬場送檢血清進(jìn)行檢測以驗(yàn)證該方法的應(yīng)用效果，為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的相關(guān)副豬嗜血桿菌檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及血清 抗原為HPS OMP P5基因表達(dá)并純化復(fù)性后蛋白，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)豬病研究室制備；HPS標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、HPS標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、待測血清，采自本試驗(yàn)飼養(yǎng)的未進(jìn)行HPS免疫的健康豬；待檢血清，來自廣東地區(qū)豬場HPS免疫的健康豬。

1.1.2 主要試劑 四甲基聯(lián)苯胺（TMB），牛血清白蛋白（BSA），辣根過氧化物酶（HEP）標(biāo)記羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豬IgG等。

ELISA所用溶液：包被緩沖液（0.05mol／L碳酸鹽緩沖液pH9.6）；封閉液（牛血清白蛋白1g加入100mL的包被液中混勻，現(xiàn)配先用）；洗滌緩沖液（PH7.4PBST）；抗體稀釋液（0.5g BSA 溶解于100mL PBST中）；底物緩沖液（DMSO）；TMB底物顯色液；終止液（2mol／L H2SO4）。均用分析純試劑配制。

1.1.3 儀器和設(shè)備 PSX－280B手提式高壓滅菌鍋，購自上海申安醫(yī)療器械廠；單人雙面凈化工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；680酶標(biāo)儀，購自BIO RAD公司；FC－16C高速離心機(jī)，購自ZENTRIFUGEN；恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；96孔酶標(biāo)板，購自美國COSTAR公司。

1.2 方法

1.2.1 供試血清的制備 用一次性注射器從豬前腔靜脈或耳緣靜脈采集血液5mL／頭（不加抗凝劑），室溫靜置2h～6h后，5000r／min離心5min，取上清液置于EP管中。處理好的血清置于冰箱中3℃～4℃保存?zhèn)溆?。其中，所?nèi)飼養(yǎng)的已進(jìn)行和未進(jìn)行HPS免疫接種的健康豬各10頭，某豬場送檢血清90份。

1.2.2 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的建立

1.2.2.1 基本操作程序 用包被液以1∶500稀釋度稀釋抗原液，100μL／孔加入96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板，洗滌。封閉后加樣，100μL／孔加入用抗體稀釋液按1∶100稀釋的血清，洗滌后加入用1∶5000稀釋液稀釋的酶標(biāo)二抗，再加顯色液、終止液，最后測定各孔OD450nm值。

1.2.2.2 最佳加樣作用時間的確定 ELISA抗體檢測試驗(yàn)加樣作用時間點(diǎn)分別設(shè)為15、30、45、60、75、90、105、120min，各點(diǎn)設(shè)3次重復(fù)。設(shè)各陰性檢測孔OD450nm為N，陽性檢測孔OD450nm為P，計算出P／N值平均值。結(jié)果判定[5]：選擇陽性血清OD450nm／陰性血清OD450nm比值（P／N）最大的時間點(diǎn)為最佳加樣作用時間。

1.2.2.3 最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定 ELISA抗體檢測試驗(yàn)酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間點(diǎn)分別設(shè)為15、30、45、60min。具體操作與結(jié)果判定同1.2.2.2。

1.2.2.4 HPS OMP P5抗體檢測 用同一批制備的抗原包被酶標(biāo)板，取標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各3份，待檢血清10份進(jìn)行ELLSA批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)。測定其OD450nm值，計算P／N。

用不同時間包被的酶標(biāo)板，取標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各3份，待檢血清10份進(jìn)行ELLSA批間重復(fù)試驗(yàn)。測定其OD450nm值，計算P／N。

判定標(biāo)準(zhǔn)：如樣品P／N值＞（標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450nm－空白 OD450nm）／（標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD450nm－空白OD450nm）＝3.29，則判斷為陽性，反之則判斷為陰性。

2 結(jié)果

2.1 最佳加樣反應(yīng)時間的確定

由表1可知，反應(yīng)時間在15、30、60min的P／N值較之于其他加樣時間的P／N值高且穩(wěn)定。并且，在15min時的P／N值顯著比其他時間的P／N值高（P＜0.01）。所以，最佳加樣反應(yīng)時間為15min。

2.2 最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定

為了排除加樣反應(yīng)時間對酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的影響，以較為適合的加樣反應(yīng)時間（分別為15、30、60min）進(jìn)行檢測，酶標(biāo)二抗反應(yīng)測試時間點(diǎn)分別為15、30、45、60min。表2結(jié)果顯示，在15min時的P／N值顯著高于其他時間的P／N值（P＜0.01），最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間為15min。加樣反應(yīng)時間與酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間具有一定的相互獨(dú)立性。

2.3 送檢血清樣本檢測結(jié)果

2.3.1 已進(jìn)行和未進(jìn)行HPS免疫的健康豬群檢測結(jié)果 應(yīng)用已優(yōu)化最佳加樣作用時間和酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的間接ELISA檢測方法對已進(jìn)行和未進(jìn)行HPS免疫接種的健康豬群進(jìn)行HPS OMP P5抗體檢測，結(jié)果顯示，未進(jìn)行HPS免疫接種的檢測血樣中均為HPS抗體陰性，已進(jìn)行HPS免疫接種的檢測血樣中為HPS抗體陽性的達(dá)到95%。

表1 最佳加樣反應(yīng)時間的確定Table1 The determination of the best sample reaction time

表2 酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定Table2 The determination of the best enzyme standard reaction time

2.3.2 對某豬場90份送檢血清檢測結(jié)果 應(yīng)用已建立的HPS間接ELISA抗體檢測方法對某豬場90份血清的OMP P5進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。豬場送檢的血清中陽性血清檢出率高達(dá)80%，其中母豬的陽性率較低（30%），保育仔豬陽性率較高（90%），育肥豬和哺乳仔豬高達(dá)100%。

表3 90份送檢血清OMP P5ELISA抗體的檢測結(jié)果Table3 ELISA Ab test results of OMP P5of 90sera

3 討論

隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，副豬嗜血桿菌對我國各豬場危害日趨嚴(yán)重。急需一種有效、快速的診斷方法[6]。目前，檢測HPS的方法很多，間接ELISA方法是血清學(xué)檢測方法中較為敏感、特異的方法[7]。選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA檢測方法的關(guān)鍵。在目前的大多數(shù)研究中，還是以全菌研究為主，也許是由于半菌的毒力不足以達(dá)到相應(yīng)的毒力，進(jìn)而影響到試驗(yàn)結(jié)果[8－9]。某些細(xì)菌的不同血清型間有相同的OMP免疫原性，可以產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，這不僅為開發(fā)OMP亞單位疫苗提供了理論基礎(chǔ)，而且為疾病的診斷提供了特異性抗原，今后必將成為細(xì)菌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一[10]。研究結(jié)果顯示，OMP P5蛋白具有豐富的二級結(jié)構(gòu)，其β2轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域可能形成抗原表位。OMP P5蛋白無跨膜區(qū)，提示該蛋白可能實(shí)現(xiàn)較高量及可溶性的表達(dá)。HPS OMP P5很有可能成為檢測或診斷副豬嗜血桿菌病的候選抗原，作為一種臨床上診斷 HPS的新手段[5]。

國內(nèi)外采用ELISA方法對HPS進(jìn)行檢測研究的為數(shù)不少，但從未見有針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5（OMP P5）的間接ELISA抗體檢測方法。文獻(xiàn)中采用的操作過程中加樣作用時間也不盡相同，其中以30、60、120min居多。對酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的應(yīng)用也各有差異，其中以30min和60min為反應(yīng)時間的較多[1－2]。造成檢測時間長，結(jié)果不夠穩(wěn)定，差異較大。所以，到目前為止，尚未建立一種理想的ELISA抗體檢測方法。

本研究利用HPS OMP P5基因表達(dá)并純化復(fù)性后蛋白作為包被蛋白，通過對最佳加樣作用時間的確定和最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間等條件的探索優(yōu)化，建立針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5（OMP P5）的間接ELISA抗體檢測方法。為研究獨(dú)立加樣時間與酶標(biāo)二抗時間對結(jié)果的影響，在用不同時間進(jìn)行酶標(biāo)二抗時仍對加樣時間分別在15min～120 min范圍內(nèi)進(jìn)行檢測。反應(yīng)結(jié)果顯示，加樣作用時間為15min，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間為15min，P／N值最高。所以，最佳加樣作用時間和最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間均確定為15min。

用本研究建立的間接ELISA方法對研究所內(nèi)飼養(yǎng)的未進(jìn)行HPS免疫的健康豬和進(jìn)行了HPS免疫的豬進(jìn)行檢測，前者檢測血樣中HPS均為陰性，后者檢測血樣中為HPS陽性高達(dá)95%，和實(shí)際免疫情況高度一致，檢測時間亦大大縮短。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對某豬場的90份血清進(jìn)行檢測，該豬場送檢的血清中陽性血清檢出率高達(dá)81%，其中母豬的陽性率約為30%，仔豬陽性率高達(dá)90%。說明該豬場血樣中仔豬HPS陽性率較高?？赡苁且?yàn)槟肛i分娩時為新生仔豬提供了很強(qiáng)母源免疫，仔豬體內(nèi)的母源抗體通?？梢跃S持到8周齡～12周齡。而且各豬場對于新生的仔豬都會有計劃的進(jìn)行易受感染菌的接種免疫。隨母源抗體水平下降，仔豬仍然受到母源抗體一定程度的保護(hù)，此時會出現(xiàn)亞臨床感染，仔豬自身的免疫應(yīng)答反應(yīng)將被激活，從而產(chǎn)生HPS抗體。有時哺乳仔豬群也會發(fā)病，尤其是免疫水平較低的青年母豬產(chǎn)下的仔豬。

本研究建立的間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，為副豬嗜血桿菌病的診治提供了參考方法，也為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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