張 榮，杜欣軍，徐桂香，王 菲，王 碩

（食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

奶牛乳房炎是奶牛乳腺的炎癥反應(yīng)，通常由微生物感染引起。在世界范圍內(nèi)，奶牛乳房炎都是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最重要的因素之一，并且難以控制[1]。乳房炎對于奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害包括產(chǎn)奶量下降、牛奶質(zhì)量降低和生產(chǎn)成本增高等[2]。奶牛乳房炎的預(yù)防和控制必須采取持之以恒的綜合性防治措施才有效，加強飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生是控制奶牛乳房炎的基本措施，而利用疫苗來控制奶牛乳房炎是防治本病的發(fā)展趨勢。

導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原微生物有細菌、真菌、病毒等，其中以細菌最為常見[3]。無乳鏈球菌是奶牛乳腺炎的病原菌，按Lance－field氏血清學(xué)分類，無乳鏈球菌劃歸B群。無乳鏈球菌為革蘭陽性菌，菌體為圓形或卵圓形，直徑約0.6μm～1.2μm，無鞭毛，無芽胞，最適生長溫度為36℃～37℃[4]。

傳統(tǒng)的無乳鏈球菌莢膜多糖疫苗免疫原性較弱，使其應(yīng)用受到限制[5]，而表面蛋白免疫原性較強，是一種理想的候選疫苗。此外，表面蛋白作為微生物特征性的大分子，具有較高的種屬特異性，是一種理想的免疫檢測靶標。因此，無乳鏈球菌表面蛋白的研究對于高效疫苗的研制與免疫檢測方法的建立具有重要的意義。

Alp蛋白（α－like protein，Alp）是無乳鏈球菌重要的一類表面蛋白，目前已鑒定出α、Rib、R28和Alp2等4種。其中Rib蛋白是從Ⅲ型菌株細胞壁提取物中分離出的一種高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)（123ku），其純化蛋白質(zhì)的特性與α蛋白有許多相似性，特別是這兩種純化蛋白質(zhì)的N端氨基酸順序有61%是相同的，但在免疫學(xué)性質(zhì)上無交叉反應(yīng)[6]。Rib蛋白質(zhì)對胰蛋白酶有耐受性，抗Rib抗體對Rib菌株所致的感染具有保護免疫作用[7]。Areschoug T等[8]的研究表明大多數(shù)Ⅲ型菌株和少量的Ⅱ型及Ⅴ型菌株亦能表達有Rib蛋白質(zhì)。大部分無乳鏈球菌具有Rib或α蛋白，而且已有研究顯示，如果用Rib和α蛋白一起免疫接種老鼠，不需用佐劑就可以對大部分無乳鏈球菌產(chǎn)生很強的免疫保護作用，因此Rib與α聯(lián)合疫苗與其他疫苗相比有很大優(yōu)勢[9]。

本研究成功克隆了Rib蛋白N端基因片段，并重組構(gòu)建了rib－pET26b表達載體，通過轉(zhuǎn)化宿主細胞以及誘導(dǎo)蛋白表達獲得了重組蛋白，并以此作為抗原免疫獲得了多克隆抗體，為無乳鏈球菌疫苗的開發(fā)和免疫檢測方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

無乳鏈球菌ATCC BAA－1176（Ⅲ型）購自ATCC公司；胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptone soya broth）購自O(shè)xiod公司；蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、酚、氯仿、異戊醇（25∶24∶1）、瓊脂糖，均購自BBI公司；GoTaq酶購自Promega公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 將 ATCC BAA－1176菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，用基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）提取其基因組DNA。

1.2.2 Rib基因擴增 以提取到的基因組DNA為模板，利用引物Rib F1（5′－AAGTTTGGTGCAGCTTCTGT－3′）和Rib R1 （5′－TTAGGATTATTATCAATATC－3′）進行 PCR 擴增。反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，45℃45s，72℃45 s，共進行35次循環(huán)；72℃10min。取5μL樣品進行10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒（Tiangen）進行膠回收。

1.2.3 目的基因的測序 將膠回收得到的目的基因與pEASY－T1載體連接并測序。

1.2.4 表達片段的擴增 根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計表達引 物 Rib F2（5′－TACTCAGAATTCGATTGGTATTAGTTTTTTAGG－3′，斜體部分為限制性內(nèi)切酶位點EcoRⅠ）和 Rib R2（5′－TACTCACTCGAGCTCGTCCCATTTAGGGTCTT－3′，斜體部分為限制性內(nèi)切酶位點XhoⅠ），以rib－pEASY－T1為模板進行PCR，反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30s，53℃45s，72℃45s，共進行35次循環(huán)；72℃10 min。將擴增后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行膠回收。

1.2.5 rib－pET26b重組質(zhì)粒的構(gòu)建 過夜培養(yǎng)含有pET－26b的DH5α菌株培養(yǎng)過夜，提取pet26b質(zhì)粒，將此質(zhì)粒與PCR回收得到的Rib目的基因分別用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，用DNA純化回收試劑盒分別回收后加入T4DNA連接酶連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取質(zhì)粒，利用載體引物T7 promoter和T7terminater對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。

1.2.6 誘導(dǎo)表達 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，加入終濃度為0.1mmol／L的IPTG 37℃誘導(dǎo)5h，SDS－PAGE檢測表達結(jié)果。

1.2.7 Rib蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 由于37℃條件下表達蛋白不單一，因此在低溫條件下進行誘導(dǎo)表達，并對IPTG濃度進行優(yōu)化。分別選取0.1、0.05、0.01、0.005、0.001mmol／L的IPTG，在20℃條件下誘導(dǎo)12h。為了檢測蛋白是否形成了包涵體，離心收集菌體進行超聲波破碎，利用SDS－PAGE對不同條件下的上清液和沉淀進行檢測。

1.2.8 包涵體變性復(fù)性及純化 首先利用緩沖液A（50mmol／L Tris－HCl，5mmol／L EDTA，pH 8.0）和緩沖液 B（50mmol／L Tris－HCl，5mmol／L EDTA，2mol／L脲，pH 8.0）分別對包涵體蛋白進行充分洗滌，然后使用緩沖液 C（0.1mol／L Tris－HCl，10mmol／L DTT，8mol／L脲，pH 8.0）將沉淀懸起，充分混勻，于37℃搖床快搖1h，離心將上清液置于50倍體積透析液（0.1mol／L Tris－HCl，5 mmol／L EDTA，5mmol／L Cysteins，pH 8.0）中透析2d。將透析袋中的復(fù)性蛋白取出離心，上清液與沉淀分別進行SDS－PAGE檢測。用His－tag凝膠親和柱（Novagen）純化上清液，步驟按照操作手冊進行，洗脫收集的蛋白用Bradford法測濃度，SDSPAGE檢測純化效果。

1.2.9 質(zhì)譜鑒定 將SDS－PAGE凝膠上的目的蛋白條帶切成小塊，用乙腈及胰蛋白酶等處理，完成樣品制備，然后將樣品放入質(zhì)譜儀4700Proteomics Analyzer（ABI），用4000Series及GPS軟件進行檢測，選擇NCBI數(shù)據(jù)庫檢索蛋白。

1.2.10 Rib多克隆抗體制備 將純化后Rib蛋白進行SDS－PAGE電泳，切取目的蛋白后，利用液氮充分研磨，溶于9.0g／L NaCl；將0.5mg／mL的抗原1mL與弗式完全佐劑1mL乳化后初次免疫，對雄性新西蘭大白兔背部進行多點皮內(nèi)注射；將0.25 mg／mL的抗原1mL與弗式不完全佐劑1mL乳化后加強免疫，分別于初次免疫后2、4、6周共加強免疫3次，于第3次免疫后7d，從耳緣靜脈處采血，利用間接ELISA方法[9]對抗血清效價進行測定。

2 結(jié)果

2.1 Rib蛋白基因克隆

以基因組DNA為模板，用基因特異性引物擴增目的基因，將此片段與T載體連接后進行測序，經(jīng)BLAST比對，與Rib蛋白基因同源性達到99%。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計表達引物，擴增目的基因，電泳結(jié)果顯示，目的基因在480bp左右，與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 rib－pET26b重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將目的片段與pET26b分別酶切后進行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α并篩選陽性克隆。得到的陽性克隆利用PCR和酶切對重組質(zhì)粒進行驗證，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

圖1 rib基因片段的擴增Fig.1 Amplification of rib gene fragment

圖2 PCR及酶切鑒定重組質(zhì)粒Fig.2 Recombinant plasmid verified by PCR and enzyme digestion

2.3 誘導(dǎo)表達及SDS－PAGE

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)蛋白表達（圖3）。SDS－PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后目的蛋白能夠大量表達，但同時存在兩種形式的蛋白，根據(jù)蛋白大小，推測分子質(zhì)量較高的（約23ku）為目的基因與膜間隙定位信號融合蛋白，分子質(zhì)量較低的（約18ku）為膜間隙定位信號切除后的目的蛋白。

2.4 重組蛋白表達條件優(yōu)化及蛋白形式鑒定

對誘導(dǎo)后菌體進行超聲波破碎，將上清和沉淀分別電泳，結(jié)果顯示在所有條件下，重組表達蛋白均形成包涵體。在低溫條件下，表達的蛋白僅為分子質(zhì)量較小的目標蛋白。比較不同IPTG誘導(dǎo)表達的差異，IPTG濃度為0.05mmol／L時，目的蛋白的表達量最高（圖4）。

2.5 Rib蛋白的純化與濃度測定

對包涵體進行變性、復(fù)性，利用親和凝膠對復(fù)性后Rib重組表達蛋白進行純化，結(jié)果顯示目的蛋白得到了較好的純化（圖5），蛋白濃度為0.480mg／mL。

圖3 SDS－PAGE檢測誘導(dǎo)表達Fig.3 SDS－PAGE analysis of induced protein

圖4 SDS－PAGE檢測包涵體Fig.4 SDS－PAGE analysis of inclusion bodies

圖5 純化后以及復(fù)性后SDS－PAGEFig.5 SDS－PAGE analysis of renatured and purified protein

2.6 重組蛋白的質(zhì)譜鑒定

將純化后的蛋白進行質(zhì)譜鑒定（圖6），結(jié)果顯示該蛋白與無乳鏈球菌Rib蛋白的相似性達到99.99%，確定獲得的蛋白為正確的目的蛋白。

2.7 多克隆抗體的制備

利用間接ELISA測定多克隆抗體效價，結(jié)果顯示多克隆抗體效價為1∶480000。

3 討論

本研究選擇了pET26b作為表達載體，該載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（His－Tag），表達產(chǎn)物為His融合蛋白，方便后續(xù)的親和凝膠純化。此外，該載體還含有pelB信號肽序列，位于起始密碼和目的基因之間，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細胞膜，使蛋白分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間，減少形成包涵體的可能性。本試驗在對表達的蛋白進行SDS－PAGE時有2個蛋白條帶，我們推測分子質(zhì)量較大的蛋白正是由于融合了pelB而形成的。雖然使用pET26b載體進行表達比較容易獲得可溶性蛋白，但本試驗的蛋白仍然形成了包涵體，經(jīng)過變性復(fù)性才最終獲得可溶蛋白。以上結(jié)果顯示，pET26b表達載體并不適合可溶性Rib蛋白的表達。但是這并不妨礙這一蛋白作為疫苗或作為免疫檢測靶標應(yīng)用于后續(xù)研究。

圖6 Rib質(zhì)譜鑒定Fig.6 Rib identification by MS

根據(jù)已有文獻[6]報道，對Rib蛋白的鑒定顯示它與α蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)及序列，它們都含有N端結(jié)構(gòu)域和重復(fù)序列，經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白這兩個區(qū)域的相似度分別達到61%和47%。因此通常把它們與另外兩種結(jié)構(gòu)相似的蛋白R28與Alp2同歸為Alp（α－like protein）蛋白家族，但是這兩種蛋白沒有交叉免疫性。而且α蛋白主要存在于Ia、Ib以及Ⅱ型菌株中，在Ⅲ型中不存在此蛋白，而Rib蛋白是在Ⅲ型菌株中發(fā)現(xiàn)的，而且大多數(shù)表達α蛋白的菌株都不表達Rib蛋白[10]?？梢?，僅利用α蛋白作為疫苗雖然能夠?qū)Χ喾N血清型病原菌的感染產(chǎn)生免疫保護作用，但是仍然會遺漏部分菌株。因此，利用Alp蛋白作為疫苗應(yīng)該將多種表面蛋白混合使用。本研究獲得了Rib重組蛋白，為無乳鏈球菌全面保護性疫苗的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

Gravekamp C等[11]通過動物試驗發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列會減弱整個蛋白的免疫反應(yīng)，而且通過對Rib蛋白的結(jié)構(gòu)域分析 （http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de）發(fā)現(xiàn)該蛋白N端結(jié)構(gòu)域包含跨膜區(qū)，文獻[12]顯示該區(qū)域不僅與細菌的防御機制有關(guān)，而且與細菌毒性（包括黏附，侵染甚至誘發(fā)感染性休克）密切相關(guān)，根據(jù)這些研究推測N端結(jié)構(gòu)域在刺激宿主免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用，是一段理想的候選疫苗與免疫檢測靶標。因此，本研究選擇Rib的N端序列，一方面由于片段較短便于克隆、表達，另一方面，能夠更好的保證蛋白的免疫原性。

[1]Forsman P，Tilsala－Timisjarvil A，Alatossava A.Identification of staphylococcal and streptococcal causes of bovine mastitis using 16S－23SrRNA spacer regions[J].Microbiology，1997，143（11）：3491－3500.

[2]Riffon R，Sayasith K，Khalil H，et al.Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR[J].J Clin Microbiol，2001，39（7）：2584－2589.

[3]張繼東，李淑芳，苑方重，等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定和中藥防治試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2006，42（11）：32－33.

[4]金慧心，王 艷，張丹瑩.關(guān)于無乳鏈球菌感染的新進展[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，1998（12）：12.

[5]岳麗琴，周育森，張庶民，等.B族鏈球菌C5a肽酶表位的預(yù)測、分段表達及其免疫原性[J].中國生物制品學(xué)雜志，2010，23（5）：460－465.

[6]Lindahl G，Stalhammar－Carlemalm M，Areschoug T.Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens[J].Clin Microbiol Revi，2005，18（1）：102－127.

[7]Stalhammar－Carlemalm M，Stenberg L，Lindahl G.Protein Rib：a novel group B streptococcal cell surface protein that confers protective immunity and is expressed by most strains causing invasive infections[J].J Exp Med，1993，177（6）：1593－1603.

[8]Areschoug T，Stalhammar－Carlemamm M，Larsson C，et al.Group B streptococcal surface proteins as targets for protective antibodies：identification of two novel proteins in strains of serotype V[J].Infect Immun，1999，67（12）：6350－6357.

[9]清華大學(xué).大腸桿菌菌體多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用：中國，200610113827.9[P].2007－03－28.

[10]Larsson C，Stalhammar－Carlemalm M，Lindahl G.Protection against experimental infection with group B Streptococcus by immunization with a bivalent protein vaccine[J].Vaccine，1999，17（5）：454－458.

[11]Gravekamp C，Kasper D L，Michel J L，et al.Immunogenicity and protective efficacy of the alpha C protein of group B streptococci are inversely related to the number of repeats[J].Infect.Immun，1997，65（12）：5216－5221.

[12]Li J，Kasper D L，Ausubel F M，et al.Inactivation of the a C protein antigen gene，bca，by a novel shuttle／suicide vector results in attenuation of virulence and immunity in group B Streptococcus [J].Proc Natl Acad Sci，1997，94（24）：13251－13256.