饒家輝，周 虛

（吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春 130062）

干細胞（stem cell，SC）是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體。依據(jù)其分化潛能的寬窄可分為全能干細胞和三胚層多能干細胞；根據(jù)其來源可分為成體干細胞、胎兒干細胞、胚胎干細胞（embryonic stem cel1，ESC）、核移植干細胞和誘導多能干細胞。ESC作為一種高度未分化的典型多能干細胞在近年來受到了學者的廣泛研究。它是從囊胚期的內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）和早期胚胎的原始生殖細胞（primordial germ cell，PGC）中分離得到的。ESC具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。將誘導因子轉入分化的體細胞，通過基因重編程的方法獲得具有類似ESC并具有相似分化潛能的細胞稱為誘導多能干細胞（induced pluripotent stern cell，iPSC）。ESC和iPSC都依賴于基本的轉錄框架，該框架都被通常的一套核心特異性干細胞轉錄因子所支配[1]。反過來，這些轉錄因子又與特異性細胞調(diào)控因子一起調(diào)節(jié)復雜的基因表達程序，這些表達程序在驅使譜系特異化發(fā)育程序的同時，還賦予干細胞獨特的能力來維持其干性[2]。在ESC和iPSC中，有成千上萬的細胞因子表達，而Oct4和Sox2卻發(fā)揮著這一關鍵轉錄因子的調(diào)節(jié)作用。Oct4和Sox2兩種因子能維持ESC的特性，并調(diào)控胚層的選擇。Oct4能抑制向神經(jīng)外胚層分化，促進中胚層和內(nèi)胚層分化，同時Sox2能抑制向中胚層和內(nèi)胚層分化，而促進神經(jīng)外胚層分化。分化信號連續(xù)不均勻地調(diào)節(jié)著Oct4和Sox2蛋白水平，改變著他們在基因組中的結合模式，并導致細胞命運的選擇和分化[3]。

1 Oct4基因及其表達

1.1 Oct4基因的亞型

ESC是否分化及其分化方向受到胞內(nèi)多種基因的嚴密調(diào)控，Oct4基因是其中關鍵基因之一。Oct4也被稱為Oct3、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU轉錄因子家族中的一員。人的Oct4基因位于6號染色體上（6p21.31），長度為16.40kb，具有多個轉錄起始位點，轉錄不同的mRNA亞型（Isoform），從而翻譯成多種蛋白質(zhì)。目前，已發(fā)現(xiàn)Oct4基因共有11種亞型Isoform 1～11，翻譯7種蛋白質(zhì)。Isoform 1、2、3、4、5和Isoform 11各翻譯一種蛋白質(zhì)，Isoform 6～10轉錄的mRNA不同但其翻譯的蛋白質(zhì)相同[4]。限于檢測技術的發(fā)展水平，目前對Oct4Isoform的研究較少，且多數(shù)集中在Oct4 Isoform 1、3、7等3個代表性亞型，尤其是對Isoform 1的研究比較深入。Isoform 1是最普遍，也是轉錄最主要的亞型之一，在一些文獻中常被稱為Oct4A，一般關于Oct4的研究都是針對此種亞型；Isoform 3表達于胚胎4細胞以前的細胞質(zhì)和非多能細胞的細胞核中，為文獻中常提到的Oct4B，全長1157bp，編碼265個氨基酸，它不能激活Oct4依賴的啟動子轉錄下游基因，但在細胞應激反應中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用；Isoform 7在胃、腦、ESC、H9細胞系中均有發(fā)現(xiàn)，全長1733bp，編碼164個氨基酸，對其功能目前還不清楚。

1.2 Oct4蛋白質(zhì)的結構

Oct4轉錄因子具有5個外顯子，4個內(nèi)含子，全長1387bp，包含360個氨基酸殘基，其中N末端133個，POU結合區(qū)156個，C末端71個。Oct4蛋白質(zhì)的N端133個氨基酸翻譯的蛋白質(zhì)含有一個保守的結構域，它能與DNA結合，從而調(diào)控下游靶基因的轉錄，在已分化的細胞中不表達。Oct4蛋白的N端和C端各有一個脯氨酸富集區(qū)，這些脯氨酸富集區(qū)是Oct4因子的轉錄活性區(qū)。POU結合域有兩個亞區(qū)，特異結構域和同源異型結構域，每個亞區(qū)都能獨立地結合DNA八聚體基序。特異域又稱保守結構域，位于N末端，由富含脯氨酸和酸性殘基的79個氨基酸組成，序列能夠包繞DNA轉錄激活區(qū)，具有活化作用。同源域位于C末端，是磷酸化調(diào)節(jié)位點，由60個氨基酸組成，除富含脯氨酸殘基外，還有蘇氨酸和絲氨酸殘基。這兩個亞區(qū)間通過含有17個氨基酸組成的易變區(qū)相連接，經(jīng)螺旋－轉角－螺旋結構與DNA結合位點發(fā)生聯(lián)系，其回文識別序列為ATTTGAAATGCAAAT，該序列是骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的第一個內(nèi)含子，可結合兩個Oct4蛋白分子[5]。POU特異域的特征性結構為ATTTGAAA八聚體結構域，Oct4蛋白分子可與特異域結合，激活啟動子和增強子區(qū)域內(nèi)帶有順式反應元件基因的轉錄。POU同源域的特征性結構為ATGCAAAT八聚體結構域，又稱為Oct結構，Oct4分子也可通過結合同源域而活化相應靶基因，激活或抑制干細胞分化過程中基因表型的轉變[6]。

1.3 Oct4基因的調(diào)控

Oct4基因對大量靶基因及其自身編碼基因的轉錄調(diào)控，主要是通過其前饋系統(tǒng)、自身調(diào)節(jié)網(wǎng)絡和與其他信號轉導通路協(xié)同作用來實現(xiàn)。Boyer LV等鑒定出人類ESC中有623個（3%）蛋白質(zhì)編碼基因和5個（3%）miRNA編碼基因的啟動子與Oct4關聯(lián)。這些基因大約一半是Oct4、Sox2和Nanog共同的靶基因，包括參與維持ESC多潛能性和自我更新的重要調(diào)節(jié)通路 Tgf－β（如 TDGF1、LEFTY2／EBAF）和 Wnt（如 DKK1、FRAT2）的基因。在人ESC中，Oct4也可通過調(diào)節(jié)STAT 3的表達來調(diào)控JAK－STAT 3信號轉導通路，從而對細胞的增殖分化產(chǎn)生作用。此外，Oct4也會通過占據(jù)調(diào)節(jié)細胞分化的PRC2基因的靶基因而控制細胞的分化。通常認為，成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、未分化細胞轉錄因子1（undifferentiated embryonic cell transcription factor，Utf－1）和鋅指蛋白42（zinc finger protein，Zfp－42）等是Oct4在ESC中特異作用的靶基因，但 Otx2、lefty1／Ebaf、Upp／383等在ESC中也依賴于Oct4而表達。同時，ESC也存在負反饋調(diào)節(jié)機制。Niwa H等研究表明，Cdx2、雞卵蛋白上游區(qū)動子轉錄因子（chicken ovalbumin upstream promoter－transcription factors，COUP－TFs）和生殖細胞核因子（Germ cell nuclear factor，GCNF）等，可能在不同時期參與抑制Oct4的轉錄，這些反饋機制把Oct4的表達維持在特定范圍內(nèi)，從而維持ESC的未分化狀態(tài)及多能性。

1.4 Oct4基因的功能

在胚胎發(fā)育的不同階段，Oct4的表達具有嚴格的時間順序性，從2細胞到8細胞，直至桑葚胚致密化之前，Oct4在胚胎細胞中均高表達，此后表達逐漸下調(diào)，直至消失。在體外，Oct4和Nanog都只在未分化的ESC、胚胎細胞（embryonic cel1，EC）和胚胎生殖細胞（embryonic germ cel1，EGC）中表達，當誘導分化時它們表達量下降。Oct4基因敲除的小鼠只能發(fā)育到類似囊胚的階段，然而該囊胚內(nèi)細胞團中的細胞不具有發(fā)育全能性，只能形成滋養(yǎng)外胚層。ESC的多能性對Oct4的表達水平相當敏感，Oct4的過表達也能導致胚胎向中內(nèi)胚層分化。

Takahashi K等[7]將反轉錄病毒作為載體，導入4個轉錄因子 Oct4、Sox2、kLF4和C－Myc，將小鼠胚胎成纖維細胞重編程至多能狀態(tài)。他們利用同樣的4個轉錄因子導入到人類表皮成纖維細胞中，又獲得了人類iPS細胞系。與此同時，YU J等[8]利用慢病毒作為載體，導入4個轉錄因子Oct4、Sox2、Nanog、Lin28，同樣將胎兒成纖維細胞誘導為人類iPSC。Huangfu D等[9]使用丙戊酸（組蛋白乙酰基轉移酶抑制劑），只需導入Sox2和0ct4兩種因子，即可獲得iPS細胞。Nakagawa M 等[10]進一步證實，Oct4不能被其家族成員替代，而另外3個基因Sox2、kLF4和C－Myc則分別可以被Sox1或Sox3、kLF2和N－Myc或L－Myc替代。有研究表明，敲除Oct4基因時，小鼠胚胎是不能形成內(nèi)細胞群即全能干細胞；通過沉默Oct4基因，鼠和人ESC會向滋養(yǎng)層細胞分化。以上研究結果均提示Oct4在重編程過程中似乎是不可或缺的，但Shi Y等[11]發(fā)現(xiàn)BIX－01294（組蛋白甲基轉移酶G9a的抑制劑）可以替代Oct4誘導神經(jīng)干細胞形成iPSC。Lengner C J等[12]研究認為缺失Oct4的鼠成體干細胞依然能夠維持其自我更新。Heng J C等[13]報道孤核受體Nr5a2可以取代Oct4，與Sox2、kLF4一同將MEFs重編程為iPSC。這些成果為Oct4作用機制及功能研究提供了一種新的方式，有助于Oct4機制研究的不斷深入。

2 Sox2基因及其表達

2.1 Sox2蛋白質(zhì)的結構

干細胞是否選擇分化，Oct4轉錄因子是關鍵。Oct4蛋白與競爭對手POU2F1蛋白都能和一種8個堿基的DNA序列相結合。但哪種蛋白先結合，會影響到一個干細胞是分化還是保持多能狀態(tài)。Ferraris L等[14]研究表明，Sox2蛋白是決定因素，該蛋白能幫助這兩種蛋白與DNA序列結合。Sox2是一種與SRY蛋白相關的含HMG box的轉錄因子，分子質(zhì)量約為35ku。Sox2的cDNA全長約2.40kb，編碼319個氨基酸。Sox2蛋白的N末端第40～65個氨基酸內(nèi)富含疏水氨基酸，接下來是79個氨基酸的 HMG－box，緊挨 HMG－box的是一段B組的同源序列，然后是199個氨基酸的C末端。Sox2的HMG box以高度親和力結合特異的DNA靶序列（A／T）（A／T）CAA（A／T））G，其表達蛋白的C末端是其轉錄激活區(qū)域，包含了一段富含絲氨酸的序列。在脊椎動物Sox2mRNA 3′非翻譯區(qū)（3′un－translated region，3′UTR）中存在4段非常保守的富含AU的區(qū)域，Sox2的3′UTR可能參與了其轉錄后調(diào)控。Sox2與Sox1、Sox3同屬Sox家族B組的Bl亞組，它們的HMG－box同源性高達96%。與大多數(shù)轉錄因子不同的是，Sox蛋白都是在小溝處結合DNA，并引起DNA雙螺旋以80°彎曲。

2.2 Sox2基因的表達

Stevanovic M等首次克隆出人的Sox2基因，位于第3號染色體的長臂q26.3～27位置。Yuan B等從胚胎癌細胞（embryonic cancer cell，ECC）的cDNA文庫中克隆了小鼠Sox2的全長cDNA。他們發(fā)現(xiàn)Sox2基因主要是協(xié)同Oct4基因發(fā)揮調(diào)控作用，其啟動子區(qū)域缺少TATA box元件，但有一個倒轉的CCAAT box元件，位于－60bp處。CCAAT box元件能結合NF－Y、CDP和CTF／NF－1等一系列的轉錄因子。與Oct4基因相似，F(xiàn)GF、OPN、Utf－1、Fbx15等基因是Sox2作用的靶基因，他們通過對靶基因的轉錄調(diào)控或占據(jù)靶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域來共同控制多能因子的表達。

Sox2基因在成熟的ICM、外胚層和生殖細胞中均表達；在胚胎發(fā)育的不同階段均有表達。在體外，在未分化的ESC、ECC、PGC和神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）等細胞中表達，但會隨著這些細胞的分化而下調(diào)。Arnold K等[15]研究顯示，Sox2不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一些未分化的干細胞或前體細胞中表達，在成人神經(jīng)區(qū)的大腦、視網(wǎng)膜、舌、氣管、支氣管上皮細胞以及睪丸、子宮頸、晶狀體上皮細胞、腺胃、食道鱗狀上皮細胞均有表達。同時試驗證明，小鼠胚胎E13.5和E15.5的Sox2基因與成人組織表達的Sox2基因均來自ESCSox2基因，這預示著Sox2基因可能是一種“長壽”基因，在各類組織細胞的分化和自我更新中可能扮演著更加重要的角色。

2.3 Sox2基因的功能

Sox2是脊椎動物早期發(fā)育中最早表達的神經(jīng)系統(tǒng)特異性基因之一，同時在干細胞的維持中也起著關鍵作用，并常被作為一種多能性細胞譜系的分子標記。Sox2基因在成人組織細胞中表達并具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，特別是在保持組織穩(wěn)態(tài)性方面具有重要功能。為此，Sox2可以作為一個共同的干性基因，調(diào)節(jié)不同類型干細胞和組織的自我更新[16]。缺乏Sox2的胚胎由于不能形成上胚層而在附植時發(fā)生死亡，敲除Sox2基因的小鼠胚胎在著床期因卵圓柱結構缺失而死亡，而且這種囊胚無法在體外獲得非分化的細胞，只產(chǎn)生滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層樣細胞。體外敲除Sox2基因可導致ESC分化為滋養(yǎng)外胚層[17]。但隨著研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)Sox2因子并非不可或缺，可用其他轉錄因子代替。Kim JB等[18]通過導入外源性轉錄因子Oct4和kLF4或者Oct4和C－Myc，將NSC重編程為iPSC，之后他們只用了一個轉錄因子Oct4就將小鼠NSC重編程為iPSC[19]。有試驗證明[20]，敲除Sox2的小鼠ESC再導入Sox2和Oct4又恢復了ESC功能。這說明Sox2的主要功能是維持Oct4的表達，其作用機制主要是與Oct4一起組成Oct4－Sox2復合物，對Oct4的表達起協(xié)同或拮抗作用。Masui S等報道Sox2的作用在于協(xié)同Oct4激活Oct4－Sox2增強子，進而調(diào)節(jié)多能性相關基因Nanog、Oct4和Sox2的表達，使ESC維持在未分化狀態(tài)。

3 Oct4－Sox2復合物及共激活復合因子

3.1 Nanog基因的功能與結構

Nanog基因同Oct4、Sox2一樣，在早期胚胎發(fā)育和維持干細胞自我更新和多能性方面起著非常重要的作用，在ESC、EGC及ECC中表達，在造血干細胞、腔壁內(nèi)胚層、成纖維細胞、成體組織或分化的ESC中不表達[21]。Nanog是通過調(diào)節(jié) Gata6、Gata4、Oct4、Sox2及其他后生因子的表達來維持干細胞的自我更新[22]。Nanog是一個同源框基因，人、小鼠、大鼠、狗、豬、黑猩猩等的Nanog基因均具有同源性，其同源性與ANTP超家族中NK－2基因家族相似。小鼠Nanog基因的cDNA全長為2184 bp，包含一個開放閱讀框，并且包含一個較長的3′UTR，含B2重復單位，這可能有助于Nanog的表達。Nanog基因編碼305個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其結構分為3個區(qū)域，即N末端、同源結構域、C末端。同源結構域可發(fā)揮蛋白之間的相互作用及與DNA結合的作用；N末端為富含絲氨酸的96個氨基酸，C末端50個氨基酸組成了10個由色氨酸開頭的五肽重復序列，這個重復序列對于人和鼠而言高度保守。

3.2 Oct4－Sox2復合物及其功能

Oct4和Sox2作為ESC中的關鍵基因，他們對相關多能性因子的調(diào)節(jié)并非單獨發(fā)揮作用，而是形成Oct4－Sox2異二聚體復合物，這種復合體和細胞轉錄因子FoxD3分別結合Nanog基因轉錄起點－180bp和－270bp處，激活其轉錄。Oct4－Sox2復合物除結合Nanog及自身啟動子外，還經(jīng)常共同結合于 Nanog的靶基因（如FGF4、UTF1、Fbx15等）的啟動子區(qū)，協(xié)同作用，形成調(diào)控網(wǎng)絡，這些靶基因多數(shù)都參與了ESC多能性的維持。Tokuzawa Y等研究表明，與Oct4關聯(lián)的靶基因啟動子中大約有一半同時與Sox2關聯(lián)，同時與Oct4、Sox2都關聯(lián)的靶基因啟動子中90%以上也能與Nanog結合。這些均表明Oct4－Sox2復合物在ESC轉錄調(diào)控網(wǎng)絡中具有至關重要的作用。Chickarmane V等[23]利用計算機并結合生物信息學研究也進一步證實，ESC中存在一個由Oct4－Sox2－Nanog組成的可隨著外界環(huán)境信號改變而打開或閉合的雙穩(wěn)態(tài)開關。當Nanog和Oct4－Sox2復合物表達時，開關開啟，細胞增殖基因活化，分化基因抑制，細胞對外界刺激的反應降低；當上述兩個調(diào)控因子表達低時，作用相反。還有學者提出，在控制ESC多能性和自我更新時，Oct4、Nanog、FoxD3之間可能形成了一個負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。一方面，在亞穩(wěn)態(tài)水平，Oct4結合Nanog啟動子促進表達，當Oct4表達量超過穩(wěn)態(tài)，就抑制了自身和Nanog的啟動子，通過反饋調(diào)節(jié)維持Oct4在穩(wěn)態(tài)水平。另一方面，F(xiàn)oxD3拮抗過量Oct4的抑制作用，上調(diào)Nanog的表達，而Nanog和FoxD3又激活Oct4表達。

3.3 Oct4／Sox2共激活復合物及其功能

Fongt Y W等[24]利用體外重組轉錄系統(tǒng)結合生化分析技術鑒別出了一個Oct4／Sox2共激活復合物（stem cell coactivator complex，SCC），并證實SCC可直接與Oct4－Sox2復合物相互作用，共同聚集在Oct4、Sox2和Nanog基因啟動子和增強子區(qū)域，作為輔助轉錄因子起始轉錄。經(jīng)鑒定證實SCC是一種 XPC－RAD23B－CETN2（XPC）核苷酸剪切修復（nucleotide excision repair，NER）三聚體復合物，這個SCC／XPC具有維持干細胞多潛能性和基因組完整性雙重重要功能。SCC亞基的敲除會導致細胞形態(tài)明顯畸形以及堿性磷酸酶活性降低，迅速促進細胞凋亡或分化。SCC的3個亞基XPC、RAD23B和CETN2兩重和三重敲除會分別導致Nanog的mRNA水平以及很多其他的細胞標志物（Fgf4，Zfp42，and Utf1）減少到正常水平的二分之一和三分之一，而SCC單個亞基的敲除對Nanog表達只有很小的影響。

4 展望

干細胞研究在發(fā)育生物學、細胞工程、功能基因、新藥開發(fā)等基礎研究中有重要的理論價值，同時也是研究人類疾病的良好模型，其可塑性以及多向分化的潛能為臨床醫(yī)學中諸如白血病、器官移植、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等的治愈提供了可能，也為整形美容醫(yī)學、養(yǎng)生學的發(fā)展開辟了新的方向，有著極為廣泛的應用前景。近年來，體細胞重編程、去分化和多潛能干細胞來源等一系列熱點問題成為干細胞研究的焦點。Oct4和Sox2作為維持干細胞多潛能性和自我更新的兩個關鍵核心調(diào)控因子，它們不但可以調(diào)控多個維持多能性、自我更新、多向分化相關基因的表達，還參與到信號轉導、表觀遺傳調(diào)控等多個過程，因此受到各國學者的廣泛研究和關注，其功能和調(diào)控機制也越來越清晰。然而，當前干細胞的研究仍處于起步階段，存在著許多問題和困難，如誘導iPS細胞的產(chǎn)生效率低；組織細胞中Sox2基因的功能；SCC／XPC與細胞外信號通路之間是如何調(diào)控；Oct4－Sox2復合物對其他轉錄因子調(diào)控的分子機制等許多環(huán)節(jié)還不十分清楚。Wernig M 等[25]試驗證實：iPSC形成過程中，誘導因子只提供了一種啟動因素，而干細胞的多能性和自我更新是通過基因啟動后的自我調(diào)控網(wǎng)絡維持的。因此，對Oct4和Sox2這兩個關鍵性細胞因子的研究還需進一步推進和深入。

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