韓際奧 馬應(yīng)杰 王水紅 秦寶山 韓麗

(1.鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450002; 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生處 河南新鄉(xiāng) 453003)

結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸的良性腫瘤性病變,具有癌變潛能，其與結(jié)腸癌的關(guān)系倍受關(guān)注。研究證實大腸癌多起源于腺瘤,腺瘤癌變主要與其組織類型、瘤體大小及上皮異型增生有關(guān)。癌變過程是一個多階段、多基因改變的復(fù)雜過程，癌變的時間約需5～10年[1]。鈣衛(wèi)蛋白、鈣激活蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)國內(nèi)外已有較多報道，但對結(jié)直腸腺瘤組織中這2種蛋白的表達(dá)情況報道較少。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法對結(jié)直腸腺瘤黏膜組織中鈣衛(wèi)蛋白、鈣激活蛋白的表達(dá)情況進行了檢測，分析它們在2種組織中表達(dá)差異及共同表達(dá)情況，探討鈣衛(wèi)蛋白、鈣激活蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為結(jié)直腸腫瘤的早期診斷、分期及預(yù)后等提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院2008年11月至2009年11月消化內(nèi)鏡室行結(jié)腸鏡檢查病人患者，共發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤61例，其中男31例,女30例。年齡范圍7～82歲,平均46.5歲。全部病例均按結(jié)腸鏡檢查常規(guī)準(zhǔn)備,應(yīng)用奧林帕斯-240、潘太克斯3500電子結(jié)腸鏡進行檢查。腺瘤部位和大小、形態(tài)以內(nèi)鏡下描述為準(zhǔn)。其中結(jié)腸腺瘤35例,直腸腺瘤26例。內(nèi)鏡下電切或活檢的結(jié)直腸病理組織標(biāo)本由2位高年資病理醫(yī)師進行診斷與分型。腺瘤組織學(xué)類型如下:管狀腺瘤33例、混合性腺瘤15例、絨毛狀腺瘤例12例,鋸齒狀腺瘤1例。其中非不典型增生36例,不典型增生22例,早期癌變3例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 組織標(biāo)本均常規(guī)經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定,酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,做4μm連續(xù)切片。每例取8張連續(xù)切片,其中2張用于HE染色進行病理分型,其余6張分別用于鈣衛(wèi)蛋白和鈣激活蛋白免疫組化染色。

1.2.2 主要組化試劑及方法 羊抗人鈣激活蛋白多克隆抗體(Santa Cruz公司,美國)，SABC(鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物)免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組化采用SABC法進行。鼠抗人鈣衛(wèi)蛋白單克隆抗體購自Thermo公司，免疫組化試劑盒購自天津市津脈基因測繪技術(shù)有限公司。采取鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色方法(S-P法)檢測鈣衛(wèi)蛋白的表達(dá)。

1.3 Cap43的定量分析及結(jié)果判定

鈣衛(wèi)蛋白結(jié)果判定:采取已知的陽性切片作陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。細(xì)胞漿或胞膜染色強度判定:不著色(-);淺棕黃色(+);棕黃色(++);棕褐色(+++)。+ — +++細(xì)胞數(shù)＞15%為陽性表達(dá),＜15%為陰性表達(dá)。

鈣激活蛋白結(jié)果判定:陽性對照采用鈣激活蛋白高表達(dá)的小鼠腎臟作為對照;空白對照用PBS代替特異性一抗。細(xì)胞漿或胞膜染色強度判定:不著色(-);淺棕黃色(+);棕黃色(++);棕褐色(+++)。+— +++細(xì)胞數(shù)＞5%為陽性表達(dá),＜5%為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 11.5軟件包對所得結(jié)果進行χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗，以P=0.05為檢驗水準(zhǔn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鈣衛(wèi)蛋白、鈣激活蛋白在結(jié)直腺瘤組織中的表達(dá)及與各病理因素之間的關(guān)系

鈣衛(wèi)蛋白的表達(dá)與患者性別、腫瘤部位、組織類型無關(guān)(P＞0.05)。3種病理異型組織的表達(dá)差異存在差異，非癌變組(非不典型增生加不典型增生)陽性表達(dá)率要明顯低于癌變組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.539，P=0.063)。鈣激活蛋白的表達(dá)同樣與患者性別、腫瘤部位、組織類型無關(guān)(P＞0.05)。但不同病理異型性組織的鈣激活蛋白表達(dá)率之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.882，P=0.019)，與非不典型增生和不典型增生組織相比較，早期癌變組織鈣激活蛋白表達(dá)率明顯降低,見表1。

2.2 鈣衛(wèi)蛋白、鈣激活蛋白表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)性

對同一組織標(biāo)本同時進行鈣激活蛋白及鈣衛(wèi)蛋白的表達(dá)情況分布如表2所示。統(tǒng)計顯示2種蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)系數(shù)r=-0.104，關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.425)。

表1 鈣衛(wèi)蛋白、鈣激活蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤各病理因素之間的關(guān)系[例(%)]

表2 鈣衛(wèi)蛋白、鈣激活蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性

3 討論

鈣衛(wèi)蛋白是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞胞漿來源的含鈣蛋白，主要來源于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能，在許多炎癥情況下含量增加，可作為急性炎癥性標(biāo)志物。有研究顯示在結(jié)直腸癌中，糞便鈣衛(wèi)蛋白的含量明顯升高[2]。鈣激活蛋白(calcium actived protein,Cap43)基因又名N-myc下游調(diào)節(jié)基因,是美國學(xué)者Salnikow在研究鎳的致癌機理中發(fā)現(xiàn)的新基因[3]。被認(rèn)為在多種類型的腫瘤中可作為有效的診治指標(biāo)[4]。在我們的前期研究中對結(jié)直腸癌組織中鈣激活蛋白、鈣衛(wèi)蛋白表達(dá)進行檢測發(fā)現(xiàn)2種蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的性別、部位及癌組織病理類型、分化程度均無關(guān)。但2種蛋白在結(jié)直腸正常組織、腺瘤組織和癌組織中表達(dá)水平存在著明顯差異。鈣激活蛋白在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)顯著低于結(jié)直腸正常組織和腺瘤組織,于此相反，鈣衛(wèi)蛋白在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)顯著高于結(jié)直腸正常組織和腺瘤組織,并且其實際表達(dá)于結(jié)直腸癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞，主要位于中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)中[5～7]。本次我們檢測對比了結(jié)腸腺瘤中2種蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)2種蛋白的表達(dá)與均與結(jié)直腸腺瘤患者的性別、部位及組織病理類型無關(guān)。但與腺瘤的病理異型性有著密切相關(guān)性。發(fā)生早期癌變的組織中鈣衛(wèi)蛋白表達(dá)率明顯升高，而鈣激活蛋白表達(dá)率顯著下降，這種變化趨勢與它們在結(jié)直腸良惡性腫瘤表達(dá)的差異是一致的。提示在腺瘤癌變的早期已經(jīng)出現(xiàn)鈣衛(wèi)蛋白及鈣激活蛋白表達(dá)的異常，鈣衛(wèi)蛋白的高表達(dá)及鈣激活蛋白的低表達(dá)可成為早期預(yù)測腺瘤癌變的的分子生物學(xué)指標(biāo)。

鈣衛(wèi)蛋白由兩條重鏈14和一條輕鏈8非共價結(jié)合形成異二聚體,每條鏈可結(jié)合2個鈣離子,在鈣離子存在的情況下具有抗蛋白酶活性,在腸腔和外界環(huán)境中長期保持穩(wěn)定,不被各種酶和細(xì)菌破壞。Salnikow[3]等研究鎳化合物產(chǎn)生cap43過程中發(fā)現(xiàn),游離鈣離子載體A23187刺激cap43基因的大量表達(dá)，提示細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子升高是誘導(dǎo)cap43基因表達(dá)的重要原因。作為同樣與鈣離子相關(guān)的蛋白，推測可能存在某種關(guān)聯(lián)，但我們的研究表明，雖然它們在腺瘤的癌變中表現(xiàn)了相反的變化趨勢，但這種變化不存在關(guān)聯(lián)性。

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