袁爽 宋俐 葛清蓮

(鄭州市兒童醫(yī)院皮膚科 鄭州 450053)

皮膚血管瘤是嬰幼兒最常見的一種良性腫瘤,是以毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為主要特征。血管瘤好發(fā)于頭面部,發(fā)生率在嬰幼兒時(shí)期較高,表現(xiàn)為出生時(shí)或出生后不久呈鮮紅色斑,并迅速增大,經(jīng)6個(gè)月～1年的增生期后進(jìn)入退化期,7～8歲時(shí)大部分退化,退化后可遺留色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張、纖維和脂肪沉積。血管瘤較引人注目的是其發(fā)生、發(fā)展和自行退化的機(jī)制。血管生成是多種因子調(diào)控與影響的過(guò)程,Ang-2是其中一種重要的促血管生成因子?，F(xiàn)已證實(shí)Ang-2在生理性和病理性血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而且參與血管瘤的發(fā)生和增殖,為了研究Ang-2在血管瘤中的作用,我們利用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定Ang-2在血管瘤中的表達(dá)情況,進(jìn)而探討其在血管瘤增殖中的作用及意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取河南省人民醫(yī)院血管瘤科2005至2010年共60例手術(shù)切除標(biāo)本,其中男30例,女30例,患兒年齡為1個(gè)月～13歲,平均5.5歲。按照Mulliken標(biāo)準(zhǔn)[1],將血管瘤標(biāo)本分為增殖期、消退早期和消退晚期。血管瘤標(biāo)本共50例,其中增殖期30例,消退早期10例,消退晚期10例;均取自皮膚。另取10例含有正常血管的皮膚標(biāo)本作為對(duì)照。全部標(biāo)本為10%甲醛固定,石蠟包埋。

1.2 主要試劑

鼠抗人單克隆抗Ang-2抗體、S-P超敏免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒、EDTA均購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)采用鏈霉菌素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法(即S-P法)。4μm厚度連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟入水,一抗為鼠抗人單克隆抗Ang-2抗體(克隆號(hào)JH121),所有操作按照SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。抗原修復(fù)采用EDTA抗原修復(fù)液熱浴修復(fù)。DAB染色,蘇木素復(fù)染。同時(shí)用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

表1 Ang-2在血管瘤不同時(shí)期中的表達(dá)

1.4 結(jié)果判定

每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。按著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記分,＜20%為0分;20%～50%為1分;＞50%為2分。按著色強(qiáng)度記分,無(wú)著色為0分;淺棕色為1分;深棕色為2分。將著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記分與著色強(qiáng)度記分相乘,總記分0分為陰性(-);1～2分為弱陽(yáng)性(+);4分為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,對(duì)Ang-2在血管瘤不同分期中及不同年齡組中的表達(dá)采用卡方檢驗(yàn)和確切概率法。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Ang-2定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿,呈棕黃色顆粒。在30例增殖期血管瘤標(biāo)本中有27例Ang-2表達(dá)呈陽(yáng)性,陽(yáng)性表達(dá)率為90%;在10例消退早期血管瘤標(biāo)本中有6例Ang-2表達(dá)呈陽(yáng)性,陽(yáng)性表達(dá)率為60%;在10例消退晚期血管瘤標(biāo)本中有2例Ang-2表達(dá)呈陽(yáng)性,陽(yáng)性率為20%。在10例正常血管標(biāo)本中均未見陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)Ang-2的表達(dá)進(jìn)行χ2檢驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在血管瘤的不同分期中其表達(dá)率存在顯著性差異(表1,P<0.05)。

3 討論

Fam等[2]認(rèn)為血管形成包括細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白分解,內(nèi)皮細(xì)胞移行和增生,細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,血管狀結(jié)構(gòu)的形成和管道再通。血管瘤是血管生成異常性疾病,血管生成不受控制是其增殖的主要原因[3]。Ang-2可以對(duì)血管生成的各步驟產(chǎn)生影響,從而調(diào)節(jié)血管的生成。Ang-2是存在于內(nèi)皮細(xì)胞的特異性生長(zhǎng)因子,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有極強(qiáng)的促有絲分裂作用,而對(duì)其它細(xì)胞無(wú)此作用[4]。在腫瘤、缺血缺氧等情況下,Ang-2及其受體呈現(xiàn)高表達(dá),而Ang-2不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致血管腔閉合、血管退化[3]。在對(duì)HE染色的血管瘤標(biāo)本進(jìn)行分類時(shí)觀察到:在增生期的血管瘤標(biāo)本中可見血管叢的內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍,細(xì)胞肥大,界限不清,常聚集成團(tuán),管腔不規(guī)則,甚至閉塞。間質(zhì)內(nèi)纖維組織很少并有較多的肥大細(xì)胞。而從消退早期到消退晚期,則血管內(nèi)皮細(xì)胞逐漸變扁平,內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,管腔明顯可見。同時(shí)血管間距逐漸增大,血管間結(jié)締組織逐漸增多,并且出現(xiàn)較多脂肪細(xì)胞。在血管瘤的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)血管密集,管腔擴(kuò)張明顯,且其內(nèi)皮細(xì)胞與正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)差別,無(wú)異常增生現(xiàn)象。免疫組化結(jié)果顯示:Ang-2在血管瘤增殖期、消退早期、消退晚期的表達(dá)陽(yáng)性率是依次遞減的,而在正常血管標(biāo)本中均未見陽(yáng)性表達(dá)。目前認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受多種因素的調(diào)節(jié),而Ang-2正是其中之一。Ang-2的作用機(jī)制包括:(1)刺激血管新生的作用是通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[3～4]。(2)可以提高血管通透性。(3)可以改變胞外基質(zhì),使其更有利于血管的生長(zhǎng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了Ang-2在促血管瘤發(fā)生中的重要作用。

[1]Mulliken JB,Glowack i J.Hemangiom as and vascular malform ations in infants and children:A classif icat ion based on endothelia lcharacterist ics[J].Plast Reconst Surg,1982,69:412.

[2]袁新初,周乾毅.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1在毛細(xì)血管瘤組織中的表達(dá)[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2002,23(3):213～214.

[3]Fam NP,Verm a S.C l in ical gu ide to angiogenesis[J].Circular-tion,2003,108(21):2613～2618.

[4]易成剛,郭樹忠.血管新生的機(jī)制及在整形外科領(lǐng)域中的研究進(jìn)展[J].實(shí)用美容整形外科雜志,2004,15:315～317.