唐雪蓮，付京花，，楊新穎

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642;2韓國圓光大學(xué)醫(yī)學(xué)院，全羅北道益山570749，韓國;3中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海201203)

結(jié)腸癌是世界上致死率較高的疾病之一.在美國，結(jié)腸癌在癌癥病人的死亡率中位居第二位［1-2］.盡管5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、依立替康等有一定的毒性，但它們?nèi)匀皇桥R床常用的幾種抗結(jié)腸癌藥物［3-5］.在抗腫瘤新藥研究中，體內(nèi)試驗是必要的.5-氟尿嘧啶常被用作陽性藥來間接評價新藥的藥效，但不同研究者采用5-氟尿嘧啶作為陽性藥時使用的藥物劑量不一［6-8］.劑量不同，5-氟尿嘧啶的藥效與毒性差異很大，若試驗中選用的劑量不合適，可能會因藥效不好或毒性過大引起動物死亡率過高進而發(fā)揮不了陽性藥的對照效果.本文對5-氟尿嘧啶在小鼠結(jié)腸癌模型中的藥效與毒性進行研究，評價5-氟尿嘧啶的藥效和毒性與給藥劑量之間的關(guān)系，得到適合的劑量，以期為5-氟尿嘧啶在體內(nèi)結(jié)腸癌模型研究中作為陽性藥時的劑量選擇提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

細胞培養(yǎng)試劑為Invitrogen公司(美國)產(chǎn)品，5-氟尿嘧啶(Sigma公司，美國)用無菌生理鹽水配制，其他常規(guī)化學(xué)試劑均為Sigma公司(美國)產(chǎn)品.

1.2 細胞培養(yǎng)

BALB/c小鼠來源的CT26細胞株購自韓國細胞庫(the Korean Cell Line Bank，韓國，首爾).采用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃ 體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL).

1.3 動物及分組

動物試驗在韓國圓光大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心進行.5周齡雌性BALB/c小鼠50只(SPF級，購自O(shè)rient Bio.公司，韓國，首爾).按后續(xù)試驗操作，隨機分為5組.

1.4 小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌模型的制備及藥物效果觀察

小鼠皮下結(jié)腸癌模型參考文獻［9］方法制備.取培養(yǎng)的CT26細胞用無血清RPMI1640調(diào)整為2×103μL-1注射于小鼠右前腋下的皮下部位，觀察腫瘤的生長情況，待1周后各組腫瘤直徑為4～5 mm時，將荷瘤小鼠隨機分為5組;1組為空白對照組，腹腔注射生理鹽水，每日1次，連續(xù)5 d;另外4組按體質(zhì)量分別腹腔注射10、20、30、50 mg/kg的5-氟尿嘧啶，每日1次，連續(xù)5 d.定期稱小鼠體質(zhì)量，給藥前一天記為第0天，第0天的荷瘤小鼠的體質(zhì)量為初始體質(zhì)量，不同天數(shù)的體質(zhì)量變化率根據(jù)公式 ［(測定體質(zhì)量/初始體質(zhì)量)×100%］計算.每隔3 d用游標卡尺測量腫瘤的直徑，按照公式(長×寬2)/2計算腫瘤體積，待對照組腫瘤直徑為15 mm時［10］，將所有小鼠用乙醚麻醉后，分離腫瘤，摘取肺、脾、胸腺、肝稱質(zhì)量，用體積分數(shù)為10%的甲醛固定后，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤及各組織的形態(tài)學(xué)變化.

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用“平均值±標準誤”表示.統(tǒng)計學(xué)檢驗采用SPSS 12.0軟件包單因素方差分析處理.

2 結(jié)果

2.1 5－氟尿嘧啶抗腫瘤效果

在小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌模型中，5-氟尿嘧啶表現(xiàn)出劑量依賴性抗腫瘤效果(圖1)，10 mg/kg劑量組有一定的抑制趨勢，但效果不顯著;20和30 mg/kg劑量組與對照組相比差異顯著，尤其是30 mg/kg組，在第15天時，抑瘤率達56%.50 mg/kg組的腫瘤體積與給藥前相比幾乎沒有變化，其抑制效果最顯著.從腫瘤切片的結(jié)果也可觀察到相似的結(jié)果，10 mg/kg組與空白組相似，20 mg/kg組腫瘤細胞主要聚集于腫瘤塊周圍，中央的細胞大部分壞死，30和50 mg/kg組壞死面積更大(圖2).

圖1 5-氟尿嘧啶抗腫瘤效果Fig.1 Anti-tumor effects of 5-fluorouracil in mice

2.2 5－氟尿嘧啶對小鼠體質(zhì)量和存活率的影響

從表1中可以看出，空白組體質(zhì)量在試驗期間比較接近初始體質(zhì)量，而10和20 mg/kg組體質(zhì)量有所增加;30 mg/kg組先減少，后恢復(fù)到接近初始體質(zhì)量;50 mg/kg組小鼠從第8天開始出現(xiàn)死亡，至第10天僅有2只小鼠存活，但狀態(tài)特別差，體質(zhì)量大幅下降，此時處死取樣，用作切片分析.

表1 小鼠體質(zhì)量變化率及死亡率1)Tab.1 Changes in body mass and mortality of mice

2.3 5－氟尿嘧啶對小鼠各組織的毒性

肺、脾、胸腺、肝等各組織的質(zhì)量指數(shù)見表2.除50 mg/kg組外，肺和肝的質(zhì)量變化不大，但脾和胸腺指數(shù)卻有明顯改變.組織切片染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除50 mg/kg組有輕度的炎癥損傷外，各組的肺的病理變化很小(圖2).脾和胸腺在10和20 mg/kg組沒有變化，但在30和50 mg/kg組有明顯的淋巴壞死及淋巴數(shù)目減少的變化(圖2).肝臟的病理變化最明顯，即使在10 mg/kg組也有局部的炎性滲透，其他組更加明顯，50 mg/kg組炎性滲透范圍更大甚至出現(xiàn)壞死(圖2).

圖2 小鼠腫瘤及不同組織HE染色結(jié)果Fig.2 Representative images following hematoxylin and eosin(HE)staining of tumor and the tissues in mice

3 討論

表2 小鼠各臟器質(zhì)量變化1)Tab.2 Mass changes of the tissues of mice

體內(nèi)試驗在抗腫瘤新藥研究中非常必要，癌癥的臨床治療，5-氟尿嘧啶常被用作陽性藥來間接評價新藥的藥效.劑量不同，5-氟尿嘧啶的藥效與毒性差異很大，若試驗中選用的劑量不合適，可能會因藥效不好或毒性過大引起動物死亡率過高進而發(fā)揮不了陽性藥的對照效果.

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶的體內(nèi)抑瘤效果與劑量密切相關(guān)，毒性也是如此.10 mg/kg劑量的抑瘤效果較差.50 mg/kg劑量抑瘤效果最好，但毒性特別大，動物的死亡率高，不適合使用.從抑瘤效果看30 mg/kg劑量比20 mg/kg劑量好，但從體質(zhì)量變化方面比較，20 mg/kg劑量體質(zhì)量呈增長趨勢，30 mg/kg劑量先下降后增長，且30 mg/kg劑量對脾、胸腺及肝臟等組織有影響，說明30 mg/kg劑量的毒性仍然較大.20 mg/kg劑量抑瘤率雖然較差，但體質(zhì)量及組織變化很小，尤其是對免疫系統(tǒng)幾乎沒影響，因此有利于動物利用自身的免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤.以上結(jié)果表明20～30 mg/kg劑量的5-氟尿嘧啶較適合于小鼠結(jié)腸癌模型中的藥效評價.關(guān)于5-氟尿嘧啶在其他小鼠抗癌模型中劑量的應(yīng)用也有不同報道.Cusack等［11］在人結(jié)腸癌細胞株LoVo裸鼠結(jié)腸癌模型中采用5-氟尿嘧啶作為陽性藥，其劑量為33 mg/kg，腹腔注射，每周2次，整個試驗周期為32 d.Stankova等［12］在人結(jié)腸癌細胞株SW-620的裸鼠模型中同樣采用了5-氟尿嘧啶作為陽性藥，其劑量為20 mg/kg，分別在試驗的第 4、8、12、16 天腹腔注射，每天1次.Houghton等［13］對包括5-氟尿嘧啶在內(nèi)的幾種抗腫瘤藥物在小鼠抗癌模型中的效果及毒性進行了評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶的最大耐受量是50 mg/kg.Ciomei等［14］在人結(jié)腸癌細胞株 HCT-116裸鼠腫瘤模型研究中也采用了50 mg/kg的劑量.Harris等［15］在人結(jié)腸癌細胞株HT29裸鼠腫瘤模型研究中采用了65 mg/kg的劑量.這些文獻報道的劑量與本文有差異主要是因為所采用的動物模型、5-氟尿嘧啶來源以及使用方法不同等因素造成.總之，在試驗時，應(yīng)該根據(jù)具體情況合理選擇藥物的劑量，才能很好地起到陽性藥的作用.

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