姚 丹，王丕武，張 君，劉占柱，關淑艷，劉思言，曲 靜

(1吉林農業(yè)大學生命科學學院，吉林長春130118;2吉林農業(yè)大學農學院，吉林長春130118)

大豆是營養(yǎng)價值很高的作物，大豆籽粒一般含有w為19% ～20%的脂肪，以不飽和脂肪酸為主，約占總脂肪酸總量的80% ～90%，飽和脂肪酸約占6% ～20%［1］.許多學者研究表明，大豆種子脂肪含量性狀的遺傳都是以加性效應為主的數量性狀遺傳，受許多數量性狀座位(Quantitative trait loci，QTL)和環(huán)境因子的共同影響［2］.傳統(tǒng)的高油、高蛋白大豆育種主要通過個體表型進行選擇，育種效率低，周期長，因此僅采用傳統(tǒng)育種途徑對這些性狀進行選擇有很大的難度［3］.分子遺傳學的發(fā)展和RFLP、RAPD、SSR、AFLP 等分子標記技術的出現，可以通過標記輔助育種來選育與目標性狀相關的品種，特別是高密度大豆遺傳圖譜的構建，將極大地推動育種事業(yè)的發(fā)展［4］.

1992年Diers等［5］利用 RFLP標記對大豆脂肪定位，報道了9個表型變異解釋率均在10%以上的與油分含量有關的QTL，位于連鎖群A和K上.Lee等［6］利用2個重組自交系群體和RFLP標記，發(fā)現脂肪含量有關的QTL共7個，表型解釋率大于10%的有4個，分別位于連鎖群R、C1和G上.張忠臣等［7］應用美國品種Charleston與東農594雜交衍生的154個F10RIL群體，共檢測到4個油分QTL，其中oil2、oil3、oil4 貢獻率為 11.2% ～16.4%;梁慧珍等［8］研究發(fā)現控制脂肪含量的11個QTL涉及A1、A2、B2、C2 和 D2等5 條連鎖群.葛振宇等［9］在 E、H、I連鎖群上定位到3個與脂肪含量有關的QTL，分別可解釋21.1%、17.2%和28.0%的表型變異.國內外有關大豆脂肪含量QTL定位的研究很多，但多數都是以1年的數據為基礎進行檢測的，通過多年的數據進行QTL檢測的報道尚少.從統(tǒng)計學上講，同時分析多年的數據，能增大QTL的檢測強度，準確估計QTL的位置和效應.

本研究以高蛋白大豆品種吉育50和高油大豆品種吉農18雜交后獲得的F2及其衍生群體為材料，采用主基因+多基因混合遺傳模型(Mixed genetic model)和QTL IciMapping v 2.2完備區(qū)間作圖法(Inclusive Composite Interval Mapping，簡稱ICIM)研究大豆脂肪含量的遺傳規(guī)律，并連續(xù)3年對大豆脂肪含量進行QTL定位及效應分析，目的是探討大豆脂肪含量的遺傳特性、檢測與脂肪含量相關的穩(wěn)定存在的主效QTL，以期為應用分子標記輔助選擇培育高脂肪大豆新品種提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 選取高蛋白大豆品種吉育50為母本(P1)，高油大豆品種吉農18為父本(P2)，于2005年夏季在吉林農業(yè)大學生物中心試驗田中進行雜交，獲得F0種子，種植 F0，收獲1株種子產量為450粒的F1單株，2007年5月將單粒種成450個F2單株，親本3次重復，單株收獲后考種;2008年5月將F2收獲的236個單株形成F3家系，田間采用隨機區(qū)組試驗設計，3次重復，收獲時每個家系隨機收取10株，單株脫粒裝袋.2009年5月將236個F3:4家系種植于試驗田中，隨機區(qū)組設計，3次重復.

1.1.2 引物 本研究參照2003年Cregan等［10］發(fā)表的“大豆公共圖譜”挑選引物，初步確定了380對SSR引物.挑選引物的標準為座位分布均勻且基因多樣性程度高，并由大豆數據庫SoyBase(http:∥soybase.agron.iastate.edu)中查詢SSR的引物序列，引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 大豆總DNA的提取 2007年在田間F2單株上取等量大豆新鮮葉片，采用SDS法［11］提取大豆基因組 DNA;2008—2009年以 F2:3和 F3∶4家系為材料，在每個家系中隨機選擇15株材料，取等量大豆新鮮葉片，混合后提取大豆基因組DNA，同時提取其親本基因組DNA.

1.2.2 PCR擴增及產物電泳檢測 PCR反應體系:10 × PCR Buffer 2.5 μL、2.0 ng/μL 模板 DNA、SSR引物 1 μL、dNTPs(10 mmol/L)1 μL、Taq 酶(4 U/μL)0.25 μL、Mg2+(10 mmol/L)2.5 μL，加 ddH2O 至終體積25.0 μL.94℃預變性5 min;94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸30 s，共37個循環(huán);72℃延伸8 min，4℃保存.擴增產物進行80 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，65 W恒功率電泳90～120 min，用改進的Sanguinetti銀染方法［12］進行銀染.

1.2.3 大豆脂肪含量的測定 2007—2009年連續(xù)3年對大豆脂肪含量進行測定.具體方法:單株或家系混合脫粒后，取50 g樣品利用近紅外谷物品質分析儀(BUCHI NIRLabN-200)測得.

1.2.4 遺傳分析方法 大豆脂肪含量的遺傳分析采用蓋鈞鎰等［13］提出的主基因+多基因混合遺傳模型中 P1、F1、P2、F2和 F2∶35 個世代聯合分離分析法的遺傳模型.

1.2.5 連鎖圖譜的繪制和QTL分析 利用118對在親本間表現多態(tài)性的SSR引物在F2分離群體中進行PCR擴增，對擴增產物進行統(tǒng)計:與父本相同的帶型記為“1”，與母本相同的帶型記為“2”，雜合帶型記為“3”，缺失帶型記為“-”.應用軟件Mapmaker Exp 3.0進行圖譜的構建［14］.利用“Group”命令進行標記間的連鎖分析和分組，連鎖標記數＜8的使用“Compare”命令進行排序，連鎖標記數≥8的使用“Ripple”命令進行排序［15-16］，錯誤檢測水平設為1%，利用Rosambi函數將重組率轉化為遺傳圖距(cM).

采用QTL IciMapping v 2.2軟件，聯合3年的分子標記數據和表型數據對F2及其衍生群體的脂肪含量進行完備區(qū)間作圖，Step=1.0 cM，PIN=0.05，POU=0.1，取LOD=2.5為閾值，對QTL進行定位和效應估算［17］.

2 結果與分析

2.1 大豆脂肪含量的遺傳分析

表1列出大豆吉育50(P1)×吉農18(P2)的P1、F1、P2、F2和 F2∶3等 5 個世代的脂肪含量次數分布數據.從表1可知，F1平均表現高于P1親本平均值，F2表現為2個峰態(tài)，可能是2個或多個分布的混合，F2∶3表現為正偏態(tài)分布.

同樣對于脂肪含量的遺傳，也是先比較各個模型的AIC值及極大似然值(表2)，據AIC值最小原則，對于脂肪含量的遺傳，AIC值較低的2個模型為C和E-1，其AIC值分別為2 281.84和2 284.36，所以將這2個模型作為備選模型進行分析，進一步對模型進行適合性測驗.

表1 大豆吉育50(P1)×吉農18(P2)5個世代的脂肪含量次數分布Tab.1 The frequency distribution tables of fat content in 5 generations of soybean Jiyu50×Jinong18

表2 5個世代脂肪含量在不同遺傳模型下的似然函數值和AIC值Tab.2 The likelihood function values and the AIC values of fat content from 5 generations in different genetic model

根據AIC值最小和適合性測驗的結果，E-1模型(表3)中有6個統(tǒng)計量達到顯著水平，即有6個適合性檢驗統(tǒng)計量表明E-1模型與分離群體的分布是不一致的;而C模型(表3)中只有3個統(tǒng)計量達到顯著水平，即只有3個適合性檢驗統(tǒng)計量表明C模型與分離群體的分布是不一致的，說明絕大多數都是適合的。因此，研究確定C模型為脂肪含量的最適模型(AIC值最小，適合性檢測結果也最好)，為多基因遺傳模型，多基因遺傳率為79.15%.

表3 脂肪含量遺傳模型的適合性檢驗1)Tab.3 The suitability test of fat content genetic model

1)括號內為相應的概率;*表示在0.05水平差異顯著.

2.2 大豆脂肪含量在F2、F2∶3分離群體中的表現

對親本、F2及其衍生的F2∶3家系分別進行脂肪含量的測定和分析.結果顯示，脂肪含量在兩親本間差異較大，在F2及其衍生F2∶3家系中均表現為近正態(tài)分布且具有廣泛的分布頻率，呈現典型的數量遺傳模式(圖1).w(脂肪)在F2分離群體中的變異幅度為17.36% ～24.19%，其平均值略高于中親值，偏向父本;在 F2∶3家系中，w(脂肪)的變異幅度為17.31% ～23.34%，平均值略低于中親值，表現為中親分離，偏向母本，后代中均有超親分離現象.

圖1 大豆脂肪含量在F2和F2∶3家系中的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of soybean fat content in F2and F2:3

2.3 大豆脂肪含量QTL定位

先將本研究所選的380對SSR引物在父母本間進行多態(tài)性篩選，其中有118對引物在雙親中表現出多態(tài)性，多態(tài)率為31.05%，再用所得118對SSR引物在F2分離群體的236個單株上進行PCR擴增，經80 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后統(tǒng)計譜帶信息.利用Mapmaker Exp 3.0軟件，調出數據文件，重組率≤0.50，推測可能的連鎖群，以含有2個或2個以上標記的一組為1個連鎖群，最終將102個SSR標記劃分到25個連鎖遺傳群中，其中16個SSR標記未被整合進連鎖群中，最終構建了一張包含102個標記的大豆SSR連鎖遺傳圖譜.總長度為1 380.3 cM，標記間平均距離為13.53 cM(目前未公開報道).結合3年的分子數據和表型數據，利用QTL Ici-Mapping v 2.2完備區(qū)間作圖法對大豆脂肪含量進行QTL定位，結果見圖2及表4.

圖2 完備區(qū)間作圖法對F2分離群體3年大豆脂肪含量一維掃描(ICIM-ADD)的LOD曲線Fig.2 LOD curve of one dimensional ICIM(ICIM-ADD)for three-year fat content in F2segregating population

以F2代單株為材料，一維掃描(ICIM-ADD)時檢測到1個與大豆脂肪含量相關的主效QTL，分布于12(G)連鎖群上，可解釋31.78%的表型變異，加性效應值為-0.82，表明增加脂肪含量的等位基因來源于父本吉農18.以F2∶3家系為材料分析時，共檢測到與大豆脂肪含量相關的2個微效QTL(表4)，分布于17(M)和22(F)2個連鎖群上，加性效應值均為-0.21，表現為遺傳負效應，即增加大豆脂肪含量的等位基因均來自于父本吉農18.以F3:4家系為材料，僅在12(G)連鎖群Sat_287～Sat_342標記區(qū)檢測到1個表型變異率為37.60%的主效QTL，其加性效應值為-2.02，LOD值為4.64，距離第1個標記Sat_287的距離為13.0 cM，與在F2中檢測的qOC-12-1基因座的距離相差不超過5.0 cM，因此，研究初步認為在F2和F3:4家系中檢測到的2個QTL為同一穩(wěn)定QTL，可在今后的大豆高油標記輔助育種中加以應用.

以 F2以及 F2∶3、F3∶4家系為材料，進行二維掃描(互作)分析時，具有明顯加性效應的4個QTL在其坐標軸所對應的位置上均未檢測到顯著上位性互作.

表4 完備區(qū)間作圖法(ICIM-ADD)檢測到的大豆脂肪含量QTLs1)Tab.4 QTLs of soybean fat content detected by ICIM-ADD method

3 討論與結論

本研究利用蓋鈞鎰等［13］的主基因+多基因混合遺傳模型中 P1、F1、P2、F2和 F2∶3等 5 個世代聯合分析法分析大豆脂肪含量的遺傳方式.結果表明，大豆脂肪含量表現為多基因遺傳模型，主要受多基因控制.該結果與徐鵬［18］和王永軍［19］報道的結果基本一致，但與鄭永戰(zhàn)等［20］關于脂肪含量的結果(即大豆脂肪含量受2對加性互補主基因+多基因控制，主基因遺傳率為16.23%，多基因遺傳率為53.49%)存在一定差異.其原因可能是本研究僅針對2個親本間進行分析，另外，由于研究中使用的群體是雜交后的早期分離世代F2和F2∶3家系群體，不是穩(wěn)定的RIL群體，相對于RIL群體本研究中所得遺傳參數較少，而且用于統(tǒng)計分析的F2數據不是平均值，導致試驗結果受環(huán)境影響較大，因此，該結果還有待擴展到更多親本間的分析和驗證.

參照2003年大豆公共遺傳圖譜，將本研究中定位的大豆脂肪含量QTL與SoyBase庫中已定位的大豆脂肪含量QTL進行比較.結果顯示，F2∶3家系中位于17(M)上的qPC-17-1基因座與SoyBase庫M連鎖群中Oil4-7基因座比較，位于相同標記區(qū)間，但與第1個引物的距離相差超過5.0 cM，推測在相關區(qū)段附近可能存在脂肪含量相關的QTL簇.另外，通過與SoyBase庫中相關脂肪含量QTL信息的比較，初步確定了3個新的脂肪含量QTL，即qOC-12-1(F2)、qOC-22-1(F2∶3)和 qOC-12-1(F3:4)，其中 qOC-12-1(F2，F3:4)是1個在2年間穩(wěn)定存在的主效QTL，可在進一步的高脂肪分子標記輔助育種中加以驗證和應用.

數量性狀遺傳體系的分離分析法和分子標記定位都可以進行數量性狀的遺傳研究，且二者的分析結果又可以相互印證.本研究中對于脂肪含量的遺傳，5 個世代(P1、F1、P2、F2和 F2∶3群體)聯合分析結果表明為多基因遺傳模型;進行QTL定位分析時，在F2以及F2∶3、F3:4家系群體中共發(fā)現LOD值大小相近的2個主效QTL、2個微效QTL.總體來說，模型分析的檢測結果與QTL定位的結果大體相近.但是，本研究利用主基因+多基因混合遺傳模型分析時，并未檢測到脂肪含量的主效QTL，可能是分離分析方法僅可以檢測出QTL定位分析中效應值較高的基因，而將其他一部分基因都歸入到微效多基因的總概念之中.因此，QTL定位分析中檢測的主基因數目通常大于模型分析所檢測的主基因數目，這一結果與王賢智等［21］和徐鵬［18］的結果基本一致.將傳統(tǒng)遺傳模型分析與現代分子標記技術結合起來，必將提高定位的準確性和效率，同時也將極大地減少浪費.

致謝:感謝吉林農業(yè)大學生物技術中心的老師和研究生對本研究的支持和幫助!

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