王 軼 吳 瑩 王 洋 閻秀峰

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心/東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

喜樹(shù)(Camptotheca acuminataDecne)是我國(guó)特有的多年生亞熱帶落葉闊葉樹(shù)種，屬于珙桐科(Nyssaceae)喜樹(shù)屬，主要分布于長(zhǎng)江流域及西南各省，因其次生代謝產(chǎn)物喜樹(shù)堿具有良好的抗腫瘤活性而受到人們的廣泛關(guān)注［1］。

一些叢枝菌根真菌能夠侵染喜樹(shù)的細(xì)根并與之共生形成叢枝菌根，有研究表明:喜樹(shù)幼苗中喜樹(shù)堿含量的變化與菌根真菌侵染及菌根形成過(guò)程具有相關(guān)性［2］。為了深入探討喜樹(shù)堿與共生關(guān)系及過(guò)程的相關(guān)機(jī)理，需要對(duì)喜樹(shù)幼苗不同級(jí)別細(xì)根中的喜樹(shù)堿進(jìn)行精細(xì)分析，測(cè)定微小根段中的喜樹(shù)堿含量。然而，目前常用的基于紫外檢測(cè)器的高效液相色譜方法測(cè)定喜樹(shù)堿含量［3－5］，實(shí)驗(yàn)操作中樣品質(zhì)量通常為1～2 g喜樹(shù)干樣，所需樣品量大且靈敏度不高，無(wú)法滿足上述研究工作需求。

借助于喜樹(shù)堿具有自發(fā)熒光的特性，作者建立了基于熒光檢測(cè)器的喜樹(shù)堿含量高效液相色譜測(cè)定方法，樣品量可以降低至2 mg(干質(zhì)量)，可以滿足微量植物材料中喜樹(shù)堿含量的精確測(cè)定。

1 材料與方法

儀器:高效液相色譜系統(tǒng)，包括515型單泵、717型自動(dòng)進(jìn)樣器、2475型熒光檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司);Sorvall Legend Micro17型離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);H—H—2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);Sartorius BT25S電子分析天平(精度0.01 mg);Bransonic—321超聲波清洗機(jī)。

實(shí)驗(yàn)材料:選取成熟飽滿的喜樹(shù)種子(來(lái)源于四川省金堂縣)，用0.5%的 KMnO4浸泡消毒0.5 h，無(wú)菌水洗凈后，播入經(jīng)過(guò)121℃滅菌2 h的細(xì)沙中催芽。待有側(cè)根生成后栽植于已滅菌的花盆中，每盆1株，盆中基質(zhì)為土壤與河沙混合物(體積比3∶1，過(guò)2 mm篩，混合后121℃滅菌2 h)。移苗后于自動(dòng)控制溫室中培養(yǎng)，溫室為自然采光，晝夜溫度自然過(guò)渡(18～28℃)。40 d后對(duì)喜樹(shù)幼苗根、莖、葉、子葉及全株分別采樣，樣品烘干后用于喜樹(shù)堿含量測(cè)定。

試劑與藥品:喜樹(shù)堿對(duì)照品(批號(hào):080510)由哈爾濱峰源高科技開(kāi)發(fā)有限公司提供，經(jīng)HPLC測(cè)定純度大于99%。乙腈為色譜純(Fisher公司)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。其他試劑均為分析純。

對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備:精密稱取喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品1 mg置于50 mL容量瓶中，加乙腈超聲使其溶解，待冷卻后再用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液(20 mg·L－1)。將對(duì)照品儲(chǔ)備液分裝后，于冰箱中－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品溶液的制備:取干燥至恒質(zhì)量的喜數(shù)幼苗葉片材料于研缽中研磨成粉末，精密稱取2 mg喜樹(shù)葉粉置于5 mL容量瓶中，加入4 mL 61%乙醇，50℃下超聲提取10 min后取出，冷卻至室溫后定容。搖勻后經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，取濾液作為樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

波長(zhǎng)選擇與HPLC色譜條件確定:以質(zhì)量濃度為1 mg·L－1的喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，摸索喜樹(shù)堿熒光檢測(cè)的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。首先，以喜樹(shù)堿的最大紫外吸收波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描喜樹(shù)堿熒光的發(fā)射波長(zhǎng);然后，以所得的最大發(fā)射波長(zhǎng)，進(jìn)一步掃描激發(fā)波長(zhǎng);如此反復(fù)，最終確定最佳熒光檢測(cè)條件。結(jié)果顯示:針對(duì)喜樹(shù)堿的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為553 nm。

經(jīng)試驗(yàn)，確定HPLC色譜條件為:Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈 ∶水(體積比4 ∶6)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫;流速 1.0 mL·min－1;熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)553 nm;進(jìn)樣量20 μL。對(duì)照品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察:取對(duì)照品儲(chǔ)備液(20 mg·L－1)準(zhǔn)確稀釋成為20、40、80、160、200、320、400、800 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，按照本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=5 968.6X+2 447.9，r=0.999 6，喜樹(shù)堿溶液質(zhì)量濃度在20～800 μg·L－1范圍內(nèi)，與峰面積的線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取喜樹(shù)葉片材料，按本文的方法制備樣品溶液。吸取同一份樣品溶液，按本文確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取喜樹(shù)葉片材料，按本文的方法制備樣品溶液，于室溫下分別放置 0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%。表明:樣品溶液在24 h內(nèi)，測(cè)定結(jié)果基本保持穩(wěn)定。

圖1 喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品及喜樹(shù)幼苗樣品HPLC色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn):取喜樹(shù)葉片材料研磨、混勻后，精密稱取6份;按本文的方法制備樣品溶液;按本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析。計(jì)算得:喜樹(shù)堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.911 mg·g－1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.4%。重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn):精密稱取6份已知喜樹(shù)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.911 mg·g－1)的喜樹(shù)葉片粉末各 1 mg，分別加入喜樹(shù)堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(20 mg·L－1)45.6 μL(加入量0.912 μg)，按本文的方法制備樣品后，按照本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析。喜樹(shù)堿的平均回收率為98.41%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.88%(見(jiàn)表1)。

表1 喜樹(shù)葉片中喜樹(shù)堿的加樣回收率

樣品測(cè)定:準(zhǔn)確量取喜樹(shù)幼苗根、莖、葉、子葉和全株的樣品各3份，按本文的方法制備樣品，按照本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算喜樹(shù)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)(見(jiàn)表2)。無(wú)論是喜樹(shù)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的葉片樣品，還是質(zhì)量分?jǐn)?shù)低一些的根樣品，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小。

表2 喜樹(shù)幼苗中喜樹(shù)堿含量(n=3)

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于HPLC—熒光檢測(cè)的微量喜樹(shù)植物材料中喜樹(shù)堿含量的測(cè)定方法，只需2 mg(干質(zhì)量)喜樹(shù)材料即可實(shí)現(xiàn)對(duì)喜樹(shù)堿含量的提取和測(cè)定，相對(duì)于現(xiàn)有基于HPLC—紫外檢測(cè)的喜樹(shù)堿含量測(cè)定方法大大減小了測(cè)定樣品需要量。

相對(duì)于紫外檢測(cè)器而言，熒光檢測(cè)具有更高的靈敏度，因此適用于微量物質(zhì)的檢測(cè)。HPLC—熒光檢測(cè)器測(cè)定喜樹(shù)堿含量的方法，已用于動(dòng)物血漿中各種喜樹(shù)堿衍生物的含量測(cè)定［6－8］;但對(duì)于以喜樹(shù)植物材料為樣品的喜樹(shù)堿含量測(cè)定，目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。在對(duì)叢枝菌根真菌與喜樹(shù)幼苗共生關(guān)系的研究中，需要對(duì)喜樹(shù)幼苗不同級(jí)別細(xì)根中的喜樹(shù)堿進(jìn)行精細(xì)分析，測(cè)定微小根段中的喜樹(shù)堿含量，采用HPLC—熒光檢測(cè)法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫外檢測(cè)法成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵。以2 mg干質(zhì)量的植物樣品用于喜樹(shù)堿的提取和含量測(cè)定，可以滿足對(duì)一株喜樹(shù)幼苗不同根段、不同組織部位的微量樣品進(jìn)行喜樹(shù)堿含量測(cè)定的需求。這對(duì)今后進(jìn)一步研究叢枝菌根對(duì)喜樹(shù)幼苗生長(zhǎng)發(fā)育情況的影響以及喜樹(shù)中喜樹(shù)堿的合成及代謝機(jī)制提供了更精準(zhǔn)可靠的方法。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al.Plant antitumor agentsⅠ:The isolation and structure of camptothecin a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor fromCamptotheca acuminate［J］.Journal of the American Chemical Society，1966，88:3888－3890.

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