趙雪瓊 李 波 李 楓 張微微 胡春芳 叢日杰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (江西農(nóng)業(yè)大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué))

斑背大尾鶯(Locustella pryeri)為東亞特有的鳥類，隸屬于雀形目(Passeriformes)鶯科(Sylviidae)蝗鶯屬(Locustella)［1］779－780，［2］。2010 年，IUCN 世界瀕危物種紅皮書和國際鳥盟將其列為易危物種(VU C1)［3］。目前，在我國發(fā)現(xiàn)斑背大尾鶯有4個主要分布區(qū)域，即:江西南磯山、遼寧雙臺河口［4－5］、上海崇明島［6］、黑龍江扎龍［7］。2010 年，對上海崇明島保護(hù)區(qū)的斑背大尾鶯巢址選擇的研究表明，其鳥巢呈杯狀，巢口朝上，上邊由倒伏的枯互花米草覆蓋。而南磯山、雙臺河口、扎龍地區(qū)的鳥巢呈橢圓形，巢口側(cè)向下，位于蘆葦和互花米草下面［8］。以上兩者的巢形之間存在明顯的區(qū)別，繁殖行為的不同，揭示了國內(nèi)的斑背大尾鶯種群發(fā)生了分化。

張微微等［9］對在扎龍自然保護(hù)區(qū)、雙臺河口自然保護(hù)區(qū)、江西南磯山自然保護(hù)區(qū)3個棲息地采集的斑背大尾鶯樣本(75個體)的線粒體控制區(qū)遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明:分布在這3個棲息地的斑背大尾鶯是屬于同一個種群。由于該結(jié)果中缺乏上海崇明島保護(hù)區(qū)斑背大尾鶯的數(shù)據(jù)，仍然無法回答巢型相異與遺傳學(xué)差異之間的關(guān)系問題。筆者旨在補(bǔ)充來自上海崇明島的數(shù)據(jù)，并與其他3個棲息地的種群數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以揭示上海崇明島分布的斑背大尾鶯種群是從屬于指名亞種還是單獨(dú)作為一個獨(dú)立的種群，為制定有效的保護(hù)計劃和策略提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 羽毛樣本采集和DNA提取

采集了16份斑背大尾鶯羽毛樣本，其中11份來自上海崇明島自然保護(hù)區(qū)，5份來自遼寧雙臺河口自然保護(hù)區(qū)。獲得的樣品分析前－20°保存。羽毛樣品DNA提取采用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚—氯仿法，并使用AxyPrepTMDNA Kit(Axygen，杭州)進(jìn)行純化。

1.2 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物測序

斑背大尾鶯mtDNA D_loop區(qū)擴(kuò)增采用雀形目鶯科通用引物H1248/L437［9］。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 10 μL:0.2 mmol·L－1dNTP、1.0×PCR buffer、0.2 μmol·L－1引物、0.5 U rTaqTM DNA 聚合酶(TaKa－Ra，大連)，以及約10 ng的DNA模板。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行產(chǎn)物直接測序。測序由華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 序列分析

測序獲得的序列以及從GenBank下載的斑背大尾鶯 mtDNA D_loop區(qū)序列(EU009402～EU009431;GU166299～GU166343)用 Clustal W 方法(MEGA 4.0)進(jìn)行分析比對，然后用Kimura雙參數(shù)法(MEGA 4.0)計算各群體單倍型之間的遺傳距離。利用DNASP5.0軟件統(tǒng)計單倍型及變異位點(diǎn)，計算單倍型多態(tài)性(Hd)及核苷酸多樣性(Pi)。

單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系利用MEGA 4.0和Network 4.5軟件分析。利用Modeltest 3.7軟件計算Gamma分布的參數(shù)為0.128 8，利用 UPGMA中Jukes－Canter方法(MEGA 4.0)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分支置信度采用Bootstrap重復(fù)1 000次。并利用Network 4.5中Median－joining方法構(gòu)建單倍型網(wǎng)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 新單倍型序列的多態(tài)性

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的mtDNA D_loop序列片段長度約為770 bp(圖1)。測序后序列分析表明，從16個樣品上檢測出15個新的單倍型，其中，上海崇明島10 個單倍型:C_1、C_3、C_4、C_5、C_6、C_7、C_8、C_9、C_10、C_11;遼寧雙臺河口 5 個單倍型:S_7、S_8、S_9、S_10、S_11(表1)。上海崇明島種群單倍型中存在12個多態(tài)性位點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)換位點(diǎn)7個，顛換位點(diǎn) 7個，插入位點(diǎn) 2個，缺失2個。序列中不同的堿基在整個DNA的雙鏈中所占的百分比平均為:A(腺嘌呤)32.6%，T(胸腺嘧啶)26.5%，C(胞嘧啶)11.8%，G(鳥嘌呤)29.1%。其中 A+T比為 59.1%，高于 G+C(40.9%)。

圖1 控制區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果(部分)

表1 斑背大尾鶯控制區(qū)序列新單倍型的變異位點(diǎn)

2.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

在4個繁殖種群和1個越冬種群中，上海崇明島種群的單倍型多樣性(Hd=0.964)和核苷酸多樣性(Pi=0.004 05)高于南磯山越冬種群、南磯山繁殖種群、雙臺河口種群、扎龍種群 (表2)。5個群體的遺傳距離0.001 4～0.006 8(表3)。采用UPGMA中Jukes－Cantor方法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹與Network單倍型網(wǎng)圖結(jié)果一致(圖2與圖3)。不同地區(qū)的樣本并沒有單獨(dú)聚集在一起而是交叉聚合，而且不同地區(qū)的樣本還共享同一種單倍型(EU009402)。新定義的10個單倍型中，S_8與其他個體遺傳學(xué)距離相距較遠(yuǎn)，為一獨(dú)立分支(R);S_10、S_11聚為一支(W，置信度=99%)，剩余單倍型聚為一支(F，置信度=56%)。依據(jù)控制區(qū)每百萬年14.8%的進(jìn)化速率［10］，可以推測出 F—R 的分化發(fā)生在9.5～16.6萬 a前(遺傳距離 =0.019 3±0.005 2)，F(xiàn)—W的分化發(fā)生在5.2～10.0萬a前(遺傳距離=0.011 3±0.003 5)。

表2 不同斑背大尾鶯種群的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性

不同灰度代表不同的棲息地。圓點(diǎn)的大小與其在種群中所占比例呈正相關(guān)，線的長度與突變數(shù)量呈比例。

表3 斑背大尾鶯種群間的遺傳距離

圖2 斑背大尾鶯mtDNA控制區(qū)單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

斑背大尾鶯屬于典型的濕地鳥類，生性隱匿，對于生境要求比較嚴(yán)格，較難采集到試驗樣本。在新采集的16個樣本中，檢測出15個新的單倍型，其中上海分布區(qū)種群出現(xiàn)10個新的單倍型(表1)。4個棲息地的5個群體的遺傳距離相距較近，遺傳分化不明顯。該結(jié)果與單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和Network圖結(jié)果相一致。雖然野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)上海分布區(qū)的巢型與南磯山、雙臺河口、扎龍地區(qū)的巢型相異，但是mtDNA遺傳分析表明，上海采集的樣本與其他地區(qū)的沒有發(fā)生遺傳分化。由于mtDNA更能體現(xiàn)歷史事件(如氣候和地理因素)對種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響，而巢型相異的問題可能與捕食的壓力、當(dāng)?shù)靥厥獾沫h(huán)境等相關(guān)［11］，因而二者間缺乏關(guān)聯(lián)也是合理的。

圖3 斑背大尾鶯mtDNA控制區(qū)單倍型network圖

通常認(rèn)為，我國分布的斑背大尾鶯屬于漢口亞種(Locustella pryeri sinensis)［1］779－780，［9］。研究表明，單倍型EU009402是原始單倍型，其他的單倍型都是直接或者間接地由此發(fā)展演化形成的［9］。然而，雙臺河口新定義的3個單倍型與其他單倍型發(fā)生了明顯的分化(圖2和圖3)，其分支間的遺傳距離顯著大于各棲息地種群(約 10倍)。并且，通過2008—2010年3年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雙臺河口斑背大尾鶯種群在6月初開始營巢，而其他3個斑背大尾鶯種群大概在4月末至5月初開始營巢。這似乎揭示了雙臺河口分布的斑背大尾鶯部分發(fā)生了分化，或者后分化出的進(jìn)化支(W，R)屬于其他亞種或新亞種。目前由于斑背大尾鶯指名亞種(Locustella pryeri pryeri)mtDNA數(shù)據(jù)缺乏，無法排除其飛越大洋來到大陸繁殖的可能性。

需要說明的是，本研究所采集和分析的樣本數(shù)量有限，尚不能完全代表研究區(qū)域?qū)嶋H存在的斑背大尾鶯種群數(shù)量和遺傳結(jié)構(gòu)。另外，mtDNA的母系遺傳特性無法解決父系遺傳的問題，使得該分子標(biāo)記的使用效率受到了限制，如果能與核分子標(biāo)記結(jié)合起來，則能更真實(shí)地體現(xiàn)種群的遺傳結(jié)構(gòu)［12］，這些有待于后續(xù)的研究來解決。

致謝:本研究得到了上海崇明島自然保護(hù)區(qū)、遼寧雙臺河口自然保護(hù)區(qū)、黑龍江扎龍自然保護(hù)區(qū)、江西南磯山自然保護(hù)區(qū)以及野生動植物檢測中心的老師及同學(xué)的大力幫助，謹(jǐn)致謝忱!

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