魏曉鵬 李會平 黃大莊 唐秀光

(河北農(nóng)業(yè)大學，保定，071000)

近年來，隨著國家大力倡導林業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，在林業(yè)病蟲害防治中，生物防治越來越受到重視。白僵菌(Beauveria bassiana)作為當前世界上研究和應用最多的一種廣譜蟲生真菌，其致病力強，殺蟲譜廣，對溫血動物和植物無害且容易培養(yǎng)。我國南至海南、北抵黑龍江都有白僵菌的分布，應用白僵菌防治農(nóng)、林害蟲的種類和面積均居世界首位，防治害蟲種類達40種以上，年防治面積達67萬hm2，在控制森林害蟲的嚴重發(fā)生和減少環(huán)境污染方面，發(fā)揮著不可替代的作用［1］。然而在研究和應用過程中，菌株繼代培養(yǎng)一定代數(shù)后經(jīng)常出現(xiàn)生產(chǎn)性狀的退化，如產(chǎn)孢量減少、殺蟲毒力降低等。目前對菌株退化的研究主要集中在菌落局變、產(chǎn)孢量、殺蟲毒力變化等宏觀方面的研究，關(guān)于菌株退化的原因，自1974年Yurchenko首次報道球孢白僵菌具有異核現(xiàn)象，張志光進一步證實其在自然界以異核體形式存在后，許多學者據(jù)此推測，由于異核體不穩(wěn)定，在人工培養(yǎng)基上的培養(yǎng)過程中，異核體內(nèi)核比例不斷變化，比較適用培養(yǎng)基腐生條件類型的核被選擇出來占優(yōu)勢，但這種類型對昆蟲致病力不一定強，由此導致菌種毒力發(fā)生改變［2－3］。王成樹等［4］采用分子標記方法驗證了球孢白僵菌的異核現(xiàn)象。唐曉慶等［5］認為白僵菌在繼代培養(yǎng)中發(fā)生的菌落局變現(xiàn)象與白僵菌在生產(chǎn)和應用過程中常見的退化現(xiàn)象基本一致。其他關(guān)于白僵菌退化的遺傳學研究還鮮見報道，這就大大限制了利用生物工程技術(shù)控制菌種退化工作的進行?；蚪MDNA的提取和PCR反應是遺傳學研究的前提，因此筆者在基因組DNA提取的基礎(chǔ)上，對白僵菌RAPD反應體系及反應條件進行探索，旨在找到適宜于白僵菌退化遺傳學研究的一套完整的RAPD－PCR反應體系及反應程序。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:球孢白僵菌Bb00菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學林學院林木病理實驗室提供。

菌體制備:將1×108/mL的白僵菌孢子懸浮液，涂布于鋪有玻璃紙的PDA平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中25℃無光照培養(yǎng)5 d后刮取干菌絲，放入冰箱中－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑:隨機引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，4種dNTP、5 UTaqDNA聚合酶、DL2000 ladder marker均購于 Promega公司，Gold－View和瓊脂糖購于北京索萊寶科技有限公司，DNA提取試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(DV811))購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

基因組DNA提取:白僵菌基因組DNA提取按照試劑盒提供的說明書操作步驟進行。

RAPD－PCR正交組合優(yōu)化設(shè)計:參照李增智等［6］，引物選用 P25(5＇－AACGGTGACC－3＇)，由上海生工生物工程有限公司合成。采用L16(45)正交試驗設(shè)計，在20 μL反應體系中，選擇 Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA 5種因素，每個因素設(shè)4個水平(表1)。RAPD－PCR反應程序為94℃ 預變性2 min，94 ℃ 變性30 s，38 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)共40次，72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上(含GoldViewTM核酸染料)電泳分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相。DNA marker采用DL2000 DNA ladder分子質(zhì)量標準。RAPD反應程序主要參照韓小勇等［7］的方法。

表1 RAPD－PCR反應體系各組分加樣量

RAPD－PCR反應的退火溫度和循環(huán)次數(shù)優(yōu)化設(shè)計:確定RAPD－PCR反應體系最優(yōu)組合之后，對RAPD－PCR反應程序中的退火溫度和循環(huán)次數(shù)分別進行單因素梯度優(yōu)化，并分析比較2個因素對擴增反應的影響。退火溫度設(shè)計 30、32、34、36、38、40、42℃ 7個梯度;循環(huán)次數(shù)設(shè)計35、40、45次3個梯度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取效果

用DNA提取試劑盒(DV811)提取白僵菌基因組DNA的凝膠電泳圖譜完整性較好，條帶整齊明亮(圖1)，無降解，說明提取的DNA質(zhì)量較好，適合用于RAPD－PCR擴增。

圖1 白僵菌基因組DNA的凝膠電泳圖譜

2.2 白僵菌RAPD－PCR反應體系的正交設(shè)計組合

從圖2可以看出，在正交設(shè)計的16個組合中各組合之間擴增的結(jié)果表現(xiàn)出一定的差異性。在16個組合中6、11和13號組合未擴增出條帶，1、2、5、12、15、16號組合擴增的條帶較模糊且不穩(wěn)定，3、4、7、8、9、10、14 號組合擴增的條帶均較清晰，但以 4號組合擴增的結(jié)果最清晰、條帶數(shù)最多且穩(wěn)定性很好。因此，確定白僵菌RAPD－PCR最優(yōu)反應體系(20 μL)為:10×Buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.4 μL，4 種 dNTP(各 2.5 mmol/L)0.8 μL，隨機引物(10 μmol/L)1.4 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL，模板 DNA(10 mg/L)1 μL。

圖2 正交組合設(shè)計的RAPD－PCR反應體系擴增圖譜

2.3 RAPD－PCR反應的最優(yōu)退火溫度和循環(huán)次數(shù)

從圖3中可以看出，在RAPD－PCR反應中所設(shè)計的7個溫度梯度中30、34、40、42℃幾乎未擴增出條帶，32、36℃時擴增出的條帶較模糊，在38℃時擴增出的條帶最亮且主帶也最為清晰。

圖3 不同退火溫度下白僵菌RAPD－PCR擴增圖譜

從圖4顯示的循環(huán)次數(shù)優(yōu)化結(jié)果中可以看到，45次循環(huán)時的條帶模糊，產(chǎn)物量較少并且不穩(wěn)定，35次循環(huán)時幾乎未出現(xiàn)條帶，在40次循環(huán)時的條帶最為清晰可見并且產(chǎn)物量最多。綜合上述試驗結(jié)果確定白僵菌RAPD－PCR反應的最優(yōu)條件為:94℃預變性2 min;94℃變性30 s;38℃退火40 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán);72℃延伸5 min。

圖4 不同循環(huán)次數(shù)下白僵菌RAPD－PCR擴增圖譜

3 結(jié)論與討論

利用正交組合試驗和單因素梯度試驗對白僵菌基因組DNA、RAPD－PCR反應體系中各組分進行了優(yōu)化，得出20 μL PCR反應體系中各因素優(yōu)化組合為，10×Buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.4 μL，4 種dNTP(各 2.5 mmol/L)0.8 μL，隨機引物(10 μmol/L)1.4 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL，模板DNA(10 mg/L)1 μL;反應程序的優(yōu)化條件為，94℃預變性 2 min，94 ℃變性30 s，38 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)40次，72℃延伸5 min。該試驗結(jié)果可為研究白僵菌的退化機理和多樣性及種內(nèi)變異提供一個方便直觀的技術(shù)參考。

試驗過程中模板DNA純度和濃度的改變會影響PCR反應中每個產(chǎn)物片段的豐度，因此DNA的提取至關(guān)重要，在利用試劑盒抽提DNA的時候以下幾點可以確保提出高質(zhì)量的模板DNA。①要提前對研缽進行預冷，防止菌絲放入未預冷的研缽中研磨時DNA因高溫而降解，并且在研磨時要迅速不斷地加入液氮冷凍菌絲防止其融化;②在65℃水浴保溫時，時間在15～20 min為最宜，時間太長DNA會因高溫而降解，時間太短蛋白質(zhì)等雜質(zhì)消化不完全會污染DNA;③在加入Solution C溶液之后應將離心管上下反復顛倒使其完全混勻在停止顛倒時管內(nèi)未出現(xiàn)分層即可離心。對于高質(zhì)量的DNA模板RAPD所需要的DNA標準量在10～100 ng，本試驗所用的DNA模板量均在10 ng左右。

在RAPD技術(shù)中不同的引物對Mg2+的濃度要求也不同，其次Mg2+濃度會直接影響TaqDNA聚合酶活性，其濃度過高反應特異性就會降低，濃度過低會大大降低TaqDNA聚合酶活性，從而影響反應的產(chǎn)物量［8－11］。本試驗中所用的緩沖液(10×)不含Mg2+。dNTP作為PCR反應的原料，其濃度過高會導致TaqDNA聚合酶的錯誤摻入，濃度過低又會影響合成效率［12］，筆者采用的dNTP濃度為10 mmol/L，研究中發(fā)現(xiàn)隨著dNTP用量的減少，擴增的產(chǎn)物量在逐漸下降，條帶表現(xiàn)為暗淡甚至無條帶。因此，在試驗過程中各個因素之間需要相互的優(yōu)化組合之后才會取得較好的結(jié)果。

對PCR反應的退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行了單因素優(yōu)化。退火溫度一般參考引物的Tm值，溫度太高或太低都會影響PCR擴增的結(jié)果。因此在擴增時，設(shè)計了 30、32、34、36、38、40、42 ℃，在這 7 個溫度梯度中30、34、40、42℃幾乎未擴增出條帶，32、36、38℃ 3個退火溫度都有擴增產(chǎn)物，其中38℃時的擴增結(jié)果最理想，條帶最清晰。循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA和dNTP濃度，在PCR反應過程隨著模板DNA和dNTP濃度的減少，如果循環(huán)次數(shù)過多或過少產(chǎn)物的量都會減少，因此，在確定模板DNA和dNTP濃度后，最合適的循環(huán)次數(shù)是PCR反應的關(guān)鍵。結(jié)果表明，在40個循環(huán)時PCR產(chǎn)物量達到最大值，條帶數(shù)和清晰度為最優(yōu)結(jié)果，可滿足后續(xù)試驗研究。

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