李 鵬 遲德富 宇 佳 李曉燦 關(guān)樺楠 張 喆 王 丹

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

楊扇舟蛾(Clostera anachoretaFabricius)又名楊天社蛾，白楊天社蛾，屬鱗翅目舟蛾科，扇舟蛾屬，主要寄主是楊樹(Populusspp.)和旱柳(Salix matsudanaKodiz.)，春夏之間，幼蟲為害［1］。幼蟲取食楊樹、柳樹的葉片，常將樹葉全部吃光，嚴(yán)重影響樹木生長。由于幼蟲繁殖快、數(shù)量多、分布廣，大發(fā)生時極易成災(zāi)，為我國的重要林業(yè)害蟲之一［2］。對楊扇舟蛾的研究多集中在生物生態(tài)學(xué)，化學(xué)防治和天敵防治等方面，但目前探索出的防治方法都存在不同程度的不足，因此，尋求新型、有效、簡便的防治方法以代替化學(xué)農(nóng)藥等的使用，成為亟待解決的問題。本研究通過觸角電位生理反應(yīng)并結(jié)合“Y”型嗅覺儀的行為生測，旨在篩選出對楊扇舟蛾具有活性的適宜引誘劑、驅(qū)避劑，并確定其使用濃度。為楊扇舟蛾的監(jiān)測、防治提供科學(xué)依據(jù)，為開發(fā)新型生物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

2011年6月從哈爾濱市阿城區(qū)采集楊扇舟蛾幼蟲，置于室外養(yǎng)蟲籠中，每日添加新鮮楊樹枝葉喂養(yǎng)，成蟲羽化后，每日8:00、14:00采集。

1.2 供試化合物及其配制

供試揮發(fā)性氣味物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物和對照標(biāo)準(zhǔn)化合物的名稱、純度和來源見表1。用二氯甲烷作溶劑，分別將每種揮發(fā)性化合物配成1 mol/L(精油類稀釋100倍)的溶液，作為EAG反應(yīng)的最大濃度。在使用時分別用二氯甲烷將其稀釋成 10－1、10－2、10－3、10－4mol/L(精油稀釋1 000、10 000、100 000 倍)。

表1 供試化合物的純度和來源

1.3 觸角電位測定

以1 mol/L揮發(fā)性化合物或稀釋100倍的精油為測定觸角電位反應(yīng)(EAG)的最大測試濃度，以二氯甲烷為對照，在這個濃度下EAG反應(yīng)值顯著高于對照(P＜0.05)的揮發(fā)物，再稀釋成 1、10－1、10－2、10－3、10－4mol/L進(jìn)行進(jìn)一步的EAG測試。最后將EAG反應(yīng)值明顯高于對照(P＜0.05)的揮發(fā)物，再分別稀釋成不同濃度，在“Y”型嗅覺儀中進(jìn)行行為生測［3］。

觸角電位儀產(chǎn)自荷蘭Syntech公司，測定所需軟件也由該公司提供。測定方法參照杜永均等［4］、方宇凌等［5］。取昆蟲成蟲，先使之饑餓12 h，再用眼科手術(shù)剪將其1根觸角自基部剪下，用單面刀片切去觸角末端一小節(jié)，然后用導(dǎo)電膠固定在金屬電極上，插入EAG探針;調(diào)整氣味管使之與觸角相距1 cm。用微量取樣器抽取10 μL揮發(fā)物，均勻地滴在2 cm×0.5 cm的濾紙條上，放入10 cm長的樣品管中，樣品管末端連接氣體刺激控制裝置。待顯示器上的基線穩(wěn)定后給予刺激，刺激氣流流速、持續(xù)氣流均設(shè)定為400 mL/min。每次刺激時間為0.5 s，間隔為60 s。樣品的測試順序?yàn)殡S機(jī)排列，但在測試濃度效應(yīng)時為了減少高濃度強(qiáng)烈刺激引起的嗅覺適應(yīng)對后續(xù)刺激的影響，測試順序按從低濃度到高濃度進(jìn)行。測定各種化合物時，每個濃度同個觸角測定3次。

1.4 “Y”型嗅覺儀生物測定

“Y”型嗅覺儀主臂長24 cm，兩側(cè)臂長26 cm，側(cè)臂間夾角60°，主臂和側(cè)臂內(nèi)徑均4 cm。兩臂分別與味源瓶和對照瓶相連，在氣流進(jìn)入味源瓶之前，先經(jīng)過一個活性炭過濾器和一個蒸餾水瓶，以凈化空氣并增加空氣濕度。不同濃度刺激樣品由二氯甲烷配制而成。將10 μL刺激樣品滴加在2 cm×2 cm的濾紙條上，放入味源瓶中，將含有相同體積蒸餾水的濾紙條放入對照瓶中。以滴加二氯甲烷的濾紙條作為對照。測試前將試蟲置于養(yǎng)蟲籠中饑餓12 h。試驗(yàn)前將“Y”型嗅覺儀各部件連接好，放在空氣潔凈生測室內(nèi)。楊扇舟蛾生測選擇在遮光的房間中，僅有紅燈照明的環(huán)境下進(jìn)行。開啟大氣采樣儀，調(diào)節(jié)兩臂空氣流量均為1 mL/min，通氣10 min，保證測試時“Y”型管內(nèi)空氣清潔［6－8］。

生測時將試蟲由“Y”型管主臂管口引入，試蟲逆氣流運(yùn)動，待其爬過主臂管口2 cm后開始計時。試蟲在“Y”型管分叉處作出選擇，取向不同的側(cè)臂。每組測試5頭，待前一頭前行2 cm后再放入另一頭。觀察成蟲的行為反應(yīng)。5 min內(nèi)進(jìn)入某一臂，定為對這一側(cè)有趨性，進(jìn)入與味源瓶相連接的一臂記作該試蟲對這種氣味源有趨向性或正趨向性;進(jìn)入與對照瓶相連接的一臂記作該試蟲對該氣味源無趨向性或有負(fù)趨向性，未進(jìn)入兩臂的記作無反應(yīng)。每種化合物每次測試5頭，10次重復(fù)。更換不同氣味源時，用75%乙醇擦洗“Y”型管的內(nèi)、外壁，自然晾干，然后繼續(xù)進(jìn)行生測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

EAG反應(yīng)值由觸角電位儀讀出。

“Y”型嗅覺儀測試驅(qū)避率、引誘率及反應(yīng)率計算公式［9］:

驅(qū)避率=(對照臂內(nèi)的總蟲數(shù)/測試的總蟲數(shù))×100%;

引誘率=(處理臂內(nèi)的總蟲數(shù)/測試的總蟲數(shù))×100%;

反應(yīng)率=((對照臂內(nèi)的總蟲數(shù)+處理臂內(nèi)的總蟲數(shù))/測試的總蟲數(shù))×100%。

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Tukey多重比較。EAG反應(yīng)值用方差分析檢驗(yàn)其顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊扇舟蛾對不同植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

2.1.1 對14種揮發(fā)物最大濃度下的EAG反應(yīng)

楊扇舟蛾對10種揮發(fā)物(1 mol/L)與4種精油(原溶液稀釋100倍)的EAG反應(yīng)結(jié)果見表2。從EAG絕對值看:楊扇舟蛾對葉醇的EAG反應(yīng)最強(qiáng)，其次是對薄荷油的反應(yīng)。Tukey多重比較表明:楊扇舟蛾對丁香酚、異丁香酚、紫羅蘭酮、香葉醇、羅勒烯和α－蒎烯的EAG反應(yīng)值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，其中葉醇、薄荷油的EAG反應(yīng)值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)，對其他6種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)值與對照相比差異不顯著(P＞0.05)。

表2 楊扇舟蛾對14種揮發(fā)物最大濃度下的EAG反應(yīng)

2.1.2 對不同濃度的8種植物源揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

楊扇舟蛾成蟲對不同濃度的丁香酚、葉醇、異丁香酚、薄荷油、紫羅蘭酮、香葉醇、羅勒烯和α－蒎烯8種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)見表3。楊扇舟蛾成蟲對10－1mol/L的丁香酚的EAG反應(yīng)值最大，為0.056 mV。Tukey多重比較檢驗(yàn):成蟲在1 mol/L和10－1mol/L 2個濃度下的EAG值與對照相比差異顯著(P＜0.05)。成蟲對1 mol/L葉醇的EAG反應(yīng)值最大，為0.080 mV，對 10－2mol/L 的 EAG 值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，在 1 mol/L 和 10－1mol/L 2個濃度下的EAG值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對10－1mol/L異丁香酚的EAG反應(yīng)值最大，為0.052 mV，在 1 mol/L 和 10－2mol/L 2 個濃度下的EAG值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，在10－1mol/L濃度下的EAG值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對稀釋103倍的薄荷精油的EAG反應(yīng)值最大，為0.072 mV，對稀釋104倍的精油的EAG值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，在稀釋102與103倍2個濃度下的EAG值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對1 mol/L紫羅蘭酮的EAG反應(yīng)值最大，為 0.048 mV，在 10－2mol/L濃度下的EAG值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，在1 mol/L和10－1mol/L 2個濃度下的EAG值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對濃度為10－1mol/L香葉醇的EAG反應(yīng)值最大，為0.052 mV，在1 mol/L和10－2mol/L 2個濃度下的EAG值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，在10－1mol/L 濃度下的EAG 值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對濃度為1 mol/L羅勒烯的 EAG反應(yīng)值最大，為0.055 mV，在10－2mol/L濃度下的EAG值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，在1 mol/L 和 10－1mol/L 2 個濃度下的 EAG值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。成蟲對濃度為10－1mol/L α－蒎烯的 EAG 反應(yīng)值最大，為 0.069 mV，在1、10－2、10－3mol/L 3 個濃度下的 EAG 值與對照相比差異顯著(P＜0.05)，在10－1mol/L 濃度下的EAG值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。

表3 楊扇舟蛾對不同濃度的8種植物源揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

2.2 楊扇舟蛾對不同揮發(fā)物的行為反應(yīng)

利用“Y”型嗅覺儀測定了楊扇舟蛾成蟲對丁香酚、葉醇、異丁香酚、薄荷油、紫羅蘭酮、香葉醇、羅勒烯和α－蒎烯8種揮發(fā)物不同濃度的行為反應(yīng)結(jié)果見表4。楊扇舟蛾成蟲對1 mol/L丁香酚的反應(yīng)率較大，同時引誘率較高，達(dá)到60%。對10－1mol/L葉醇的反應(yīng)率最大，為86%，引誘率也最大，達(dá)到64%。對10－1、10－2mol/L的異丁香酚的反應(yīng)率均比較大，其中10－1mol/L的引誘率，達(dá)56%。對薄荷油反應(yīng)呈引誘效果，但引誘率不高，3種稀釋倍數(shù)下均未達(dá)到50%。對10－1mol/L的紫羅蘭酮反應(yīng)率與驅(qū)避率較大，分別達(dá)到76%和56%。對10－1mol/L的香葉醇反應(yīng)率與引誘率都較大，分別達(dá)到76%和62%。對1、10－1mol/L羅勒烯的驅(qū)避率都比較大，分別達(dá)到62%和58%。對10－1mol/L的α－蒎烯的驅(qū)避率最大，達(dá)到64%。

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用觸角電位(EAG)和“Y”型嗅覺儀測定14種植物源揮發(fā)物中對楊扇舟蛾成蟲的行為反應(yīng)起到強(qiáng)烈干擾作用的分別是葉醇、α－蒎烯。其中，濃度為10－1mol/L的葉醇對楊扇舟蛾成蟲引誘率達(dá)64%，10－1mol/L的α－蒎烯對楊扇舟蛾成蟲驅(qū)避率達(dá)64%。

表4 楊扇舟蛾成蟲對揮發(fā)物的行為反應(yīng)

植食性昆蟲在尋找寄主階段，主要通過嗅覺感受器對寄主植物特異性的化學(xué)指紋圖譜的識別而到達(dá)植物［10］。同一物質(zhì)的不同濃度對植食性昆蟲表現(xiàn)出不同的生理活性［11］，說明植物揮發(fā)物的特定濃度和不同揮發(fā)物的特定比例是影響昆蟲反應(yīng)的重要因子。楊扇舟蛾成蟲對各揮發(fā)物的EAG反應(yīng)并不是濃度越高反應(yīng)越強(qiáng)烈，可能是由于蟲體對能夠引起自身最大反應(yīng)的揮發(fā)物濃度有一定的極限。例如，楊扇舟蛾對10－1mol/L的異丁香酚、香葉醇和α－蒎烯要比低濃度或高濃度的同種化合物的EAG反應(yīng)更強(qiáng)烈。分析發(fā)現(xiàn)，EAG反應(yīng)值并沒有完全與“Y”型嗅覺儀生測結(jié)果相一致，如稀釋102倍的薄荷油對楊扇舟蛾的EAG值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)，但這個稀釋倍數(shù)并不能引起楊扇舟蛾成蟲明顯的定向作用，其中具體的原因還需進(jìn)一步的研究。在對楊扇舟蛾成蟲的生測試驗(yàn)中，遇到個別產(chǎn)卵后的試蟲表現(xiàn)出反應(yīng)較慢、不夠敏捷，這可能因?yàn)樵囅x在產(chǎn)卵前尋找寄主過程中揮發(fā)性化合物對其定向較強(qiáng)，而成蟲產(chǎn)卵后對揮發(fā)性物質(zhì)的敏感性降低，并且活動能力下降造成的，因此，在今后的試驗(yàn)中應(yīng)避免選用產(chǎn)卵后的楊扇舟蛾進(jìn)行生測試驗(yàn)。

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