任廣明 張 琦 曲娟娟 閆立龍 孫興濱

(東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱，150030) (哈爾濱工程大學) (東北農(nóng)業(yè)大學) (東北林業(yè)大學)

鉛鋅通常是礦區(qū)土壤中含量較高的有毒重金屬，它們在土壤中總是不斷地發(fā)生時空遷移和價態(tài)、形態(tài)轉(zhuǎn)化［1］。這不僅影響了土壤微生物的種類和數(shù)量、土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化等生化轉(zhuǎn)化過程，同時影響著植物的生長質(zhì)量、產(chǎn)量等［2］。鉛鋅等大多數(shù)重金屬具有可遷移性差，不能降解等特點，會在生態(tài)系統(tǒng)中不斷積累，毒性不斷增強，從而導致生態(tài)系統(tǒng)的退化［3］。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要參數(shù)，它們不僅調(diào)節(jié)著土壤動植物殘體和土壤有機物質(zhì)及其它有害化合物的分解、生物化學循環(huán)和土壤結(jié)構(gòu)的形成等過程，且對外界干擾比較靈敏，能夠較早地預測土壤環(huán)境質(zhì)量的變化過程，被認為是最有潛力的敏感性生物指標之一［4－5］。土壤中鉛鋅等重金屬的存在無疑會對土壤微生物的群落構(gòu)成產(chǎn)生一定的影響，甚至會引起優(yōu)勢種群的改變，同樣會引起微生物多樣性的降低。因此，土壤重金屬污染與土壤微生物群落之間的關(guān)系是國內(nèi)外環(huán)境科學領(lǐng)域的一個研究熱點［6］。本試驗對黑龍江省某鉛鋅礦區(qū)土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及土壤酶活性進行了研究，旨在探討該礦區(qū)鉛鋅污染程度與土壤酶活性、土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性之間的相互關(guān)系，為同類污染礦區(qū)土壤環(huán)境質(zhì)量評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

樣品采集:以鉛鋅礦區(qū)采礦口為基點，在距離礦口 100、200、400、600、800、1 000 m 處按對角線取樣法多點混合方式取樣，取樣深度20 cm。非礦區(qū)土壤樣品采自東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院試驗站。將采取土樣裝入無菌封口塑料袋內(nèi)，帶回實驗室。一部分新鮮土樣置于冰箱內(nèi)保存用于土壤細菌總DNA的提取;另一部分土樣置于室內(nèi)自然風干用于土壤理化性質(zhì)及土壤酶活性測定。

土壤重金屬含量、理化性質(zhì)及酶活性測定:土壤鉛鋅全量采用王水—高氯酸強酸消解法消化［7］，原子吸收分光光度法測定;土壤理化性質(zhì)按常規(guī)方法測定［8］;過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶酶活性按關(guān)松蔭方法測定［9］。

土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析:土壤總DNA的提取采用改良的Zhou等提出的方法［10］。純化采用天根通用型DNA純化回收試劑盒。應用細菌16S rDNA V3區(qū)域通用引物對提取的礦區(qū)土壤總DNA樣品進行擴增［10］。PCR反應條件為:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)，72℃最終延伸10 min。擴增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用Bio－Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR反應產(chǎn)物進行分離。變性梯度為30% ～60%，使用的電泳緩沖液為1×TAE，上樣量為20 μL DNA+10 μL 6×溴酚藍二甲苯氰溶液，電泳電壓150 V，60℃，300～350 min。凝膠染色采用銀染法。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0、NTSYS等統(tǒng)計軟件分析。將凝膠成像上出現(xiàn)的DNA片段計為1，不出現(xiàn)的計為0，統(tǒng)計后輸入電腦，用NTSYS聚類分析軟件進行UPGMA法聚類分析，同時運用軟件構(gòu)建7個土壤樣品細菌群落結(jié)構(gòu)相似性樹狀圖。DGGE條帶的數(shù)目可代表微生物群落的豐富度(S)?；贒GGE條帶的遷移率和條帶的強度分析細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)用Shannon－Weaver指數(shù)H來表示。Shannon－Weaver指數(shù):H=－∑(ni/N)log(ni/N)。式中:ni為峰面積，N為所有峰總面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤重金屬鉛鋅全量及酶活

2.1.1 土壤重金屬鉛鋅全量

供試土壤重金屬鉛鋅全量分析結(jié)果如表1所示。從礦口到距離礦口1 000 m處礦區(qū)土壤的重金屬鉛鋅全量逐漸降低，重金屬鉛全量分別是非礦區(qū)土壤(7 號)的 32.98、18.93、15.49、9.48、9.01、6.07倍;重金屬鋅全量分別高出非礦區(qū)土壤10.21、10.09、9.63、8.48、7.47、5.82 倍，表明礦區(qū)土壤均受到不同程度的重金屬復合污染。數(shù)據(jù)經(jīng)LSR測驗表明，從礦口到外圍各土壤中鉛鋅全量與非礦區(qū)土壤中鉛鋅全量均存在顯著性差異(P＜0.05)。土壤C/N比的變化與所在環(huán)境的水熱條件和成土作用過程密切相關(guān)［11］。從表1可以看出，供試土壤C/N比較低，這可能是由于礦區(qū)特定的地理環(huán)境所致。pH及陽離子交換量一定程度上反應土壤膠體結(jié)構(gòu)、緩沖能力、土壤肥力等，可見供試的礦區(qū)土壤緩沖能力、肥力較低，其pH和陽離子交換量與非礦區(qū)土壤均存在顯著性差異(P＜0.05)。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)

2.1.2 土壤酶活性測定

由表2可見，從礦口到外圍土壤過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶活性與非礦區(qū)土壤酶活性均存在極顯著性差異(P＜0.01)。3種土壤酶活性的變異系數(shù)分別為 37.60%、26.75%、47.22%，其中脲酶活性變異系數(shù)最大，說明礦區(qū)土壤脲酶活性的變化程度最大。從表3可知，土壤過氧化氫酶活性與全鉛、全鋅質(zhì)量分數(shù)呈顯著負相關(guān)(P＜0.05);土壤磷酸酶活性與全鉛質(zhì)量分數(shù)呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)，與全鋅質(zhì)量分數(shù)呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01);土壤中的脲酶活性與全鉛質(zhì)量分數(shù)呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)，與全鋅質(zhì)量分數(shù)呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)。土壤中的酶對土壤重金屬污染均較為敏感，礦區(qū)土壤中的重金屬污染均抑制了過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶活性。

表2 重金屬污染下土壤酶活性變化 μg·g－1

2.2 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

2.2.1 PCR－DGGE 指紋圖譜

用改良的化學裂解法提取土壤總DNA，DNA片段大小為23.1 kb。用天根土壤DNA純化回收試劑盒純化土壤總DNA，純化后進行土壤總DNA的PCR擴增，得到大小在230 bp左右的擴增產(chǎn)物，如圖1。

圖1 土壤細菌16S rDNA基因V3區(qū)PCR擴增結(jié)果

表3 土壤酶活性與鉛鋅全量之間的相關(guān)系數(shù)

DGGE指紋圖譜中條帶越豐富表明土壤微生物群落種類相對越豐富，條帶顏色越深在一定程度上可以反映該種微生物所占比例越大，數(shù)量越多［12］。圖2中，1號、2號、3號圖譜條帶相對較少，說明重金屬污染嚴重的土壤中鉛鋅對細菌產(chǎn)生了明顯的毒害作用，使得少部分細菌不能進行正常生長，致使細菌種群數(shù)量減少甚至衰亡，發(fā)生菌群的缺失，直接導致細菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;從圖2正三角標注的條帶可知，重金屬污染土壤中存在具有較強耐受重金屬能力的共有細菌，并作為優(yōu)勢細菌穩(wěn)定存在。圖譜中條帶的明暗變化表明這些細菌雖然穩(wěn)定存在，但仍受到重金屬鉛、鋅不同程度上的影響。4號、5號、6號圖譜細菌種群及數(shù)量有明顯增加(倒三角標注)，這是由于土壤中的細菌長期在重金屬的選擇作用下，不斷增強自己的耐性、抗性，具有了高度的選擇性，通過各種氧化還原、酶化等代謝活動來適應重金屬污染的環(huán)境;7號圖譜表現(xiàn)出較豐富的細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。

圖2 土壤細菌16S rDNA的PCR－DGGE指紋圖譜

細菌群落相似性聚類分析主要根據(jù)DGGE圖譜中每個樣品中不同條帶的強度和遷移率對每個樣品的條帶圖譜進行細菌群落相似性聚類分析。通過NTSYS聚類分析軟件將供試的7個土壤樣品的指紋圖譜進行UPGMA法聚類分析。從圖3可以看出:供試的7個土壤樣品在相似距離為10時分為4簇，第1簇是4號、5號、6號;2號、3號歸為一簇;1號，7號各成一簇。

圖3 DGGE聚類分析圖譜

2.2.2 土壤細菌群落豐度和多樣性指數(shù)

DGGE條帶的數(shù)目可代表微生物群落的豐富度(S)。從表4可知，不同土壤細菌群落的豐富度存在差異，其中非礦區(qū)土壤(7號)圖譜中條帶數(shù)最多(19條)，其細菌群落豐富度最大，礦區(qū)1號土壤的條帶數(shù)最少(7條)，其微生物群落豐富度最小。與非礦區(qū)土壤相比礦區(qū)土壤的微生物群落豐富度分別為非礦區(qū)土壤的 26.92%、30.77%、34.62%、38.46%、50%、69.23%，土壤細菌群落的豐富度簡明地表達了土壤細菌群落多樣性的一個方面，但它未能反映群落功能多樣性相對多度的信息［13］。

表4 供試土壤微生物群落豐富度和多樣性指數(shù)

Shannon－Weaver(H)多樣性指數(shù)是表征群落中物種數(shù)目多少、衡量群落結(jié)構(gòu)和重要性的基礎(chǔ)。物種多樣性指數(shù)越大說明各個種個體數(shù)量分布越均勻、種類越多［14］。從表4可知，土壤(1～6號)的細菌群落多樣性Shannon－Weaver指數(shù)明顯低于非礦區(qū)土壤(7號)，最大為1.15，最小為0.84。統(tǒng)計分析顯示，除1號和2號土壤細菌群落 Shannon－Weaver指數(shù)不存在差異性外，其它供試土壤細菌群落Shannon－Weaver指數(shù)的差異達極顯著水平(P＜0.01)?？梢姡寥乐屑毦娜郝浣Y(jié)構(gòu)受到了重金屬不同程度上的影響，導致細菌的群落結(jié)構(gòu)及數(shù)量出現(xiàn)了相應的降低。

3 結(jié)論與討論

PCR－DGGE是1993年由Myuzer首先應用到微生物分子生態(tài)學的一門分子生物技術(shù)［15－16］，是研究微生物群落多樣性、分析環(huán)境中微生物群落動態(tài)變化情況、了解生境對微生物群落多樣性及菌群活性影響的一種分子技術(shù)［5，17］。運用DGGE方法可以揭示環(huán)境污染條件下微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性［18］。kozdrój等［19］、趙祥偉等［20］、張洪勛等［21］已成功將PCR－DGGE方法應用于微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析。本試驗通過測定土壤理化性質(zhì)及酶活發(fā)現(xiàn)，礦區(qū)土壤重金屬鉛鋅污染嚴重，鉛鋅質(zhì)量分數(shù)與土壤酶活均成顯著負相關(guān)，這說明土壤中的重金屬抑制了細菌的正常生長，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進一步影響土壤酶活性變化，土壤酶活性較非礦區(qū)土壤偏低;試驗建立了適用于PCR－DGGE技術(shù)的重金屬污染土壤基因組DNA的快速提取方法，獲得了純度較高的DNA模板，保證了PCR擴增反應的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，進而使得細菌指紋圖譜及聚類分析真實有效。DGGE聚類分析結(jié)果顯示，距離礦口100、200、400 m土壤樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)相似性較強，相似距離相近，距離礦口600、800、1 000 m歸為一簇表觀上條帶有所增多，這是由于較低質(zhì)量分數(shù)鉛、鋅對礦區(qū)土壤細菌影響較小，重金屬污染礦區(qū)土壤中重金屬鉛、鋅質(zhì)量分數(shù)越高土壤中細菌群落及數(shù)量越少，這與 Hiroki［22］、滕應等［11］、Bisessar等［23］的研究結(jié)果相一致。重金屬污染土壤真菌、放線菌試驗正在進行中。從上述研究結(jié)果可以看出，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性是指示礦區(qū)土壤環(huán)境質(zhì)量變化靈敏、有效的生物學指標之一，并為進一步研究重金屬污染條件下土壤的質(zhì)量與功能提供了基礎(chǔ)。

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