盧海博， 萬樹青

（1.農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室，廣州 510642；2.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，張家口 075131）

隨著生產(chǎn)力水平的提高，我國除草劑發(fā)展迅速，但大部分除草劑是化學(xué)合成藥劑，施用以后由于化學(xué)殘留問題經(jīng)常對下茬作物造成藥害，所以開發(fā)高效、低毒、對環(huán)境安全的除草劑就非常重要。從植物中尋找具有農(nóng)藥活性的化合物，是開發(fā)環(huán)境和諧農(nóng)藥的一條重要途徑［1－5]。眾所周知，以天然除蟲菊和煙堿為先導(dǎo)化學(xué)物，人工合成開發(fā)出現(xiàn)代擬除蟲菊酯類和新煙堿類殺蟲劑并已取得廣泛的應(yīng)用就是一個(gè)很好的例子。

黃皮為蕓香科（Rutaceae）黃皮屬（Clausena）植物。本屬植物全世界約有30種，分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國有近10種，分布于長江以南各省，以云南南部、廣東、廣西、海南及臺灣等省分布較為集中，資源豐富。黃皮為南方特有的水果并兼有藥用價(jià)值，具有保肝降脂、解痙、抑菌及抗癌等生物活性［6－7]。除藥用外，人們也在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面展開了一系列的研究，徐漢虹［8]等發(fā)現(xiàn)齒葉黃皮（Clausena dunniana Lévl.）精油具有殺蟲作用并分離得到其殺蟲主要成分為愛草腦。萬樹青［9－10]等發(fā)現(xiàn)，黃皮［C.lansium（Lour.）Skeels]果核甲醇提取物對農(nóng)田主要雜草具有抑制生長活性。對黃皮的甲醇提取物進(jìn)行研究，并采用活性跟蹤的方法對其活性成分進(jìn)行分離，具有除草作用的化合物為黃皮素內(nèi)酯Ⅱ（2′，3′－epoxyanisolactone，結(jié)構(gòu)為圖1）。結(jié)果表明，在80μg／mL時(shí)，黃皮素內(nèi)酯Ⅱ?qū)Π薏?（Echinochloa crusgalli Linn.）的根長、莖長和鮮重抑制率分別為96.00%、84.71%和89.85%，其IC50值分別為66.9、78.4μg／mL和133.0μg／mL［11－12]。表明黃皮素內(nèi)酯Ⅱ?qū)Π薏菥哂酗@著的抑制活性，作為植物源除草劑具有一定的開發(fā)和應(yīng)用前景。黃皮素內(nèi)酯Ⅱ在國內(nèi)為首次從黃皮中分離并確定其具有除草活性，為了科學(xué)合理利用黃皮資源，為開發(fā)新型除草劑提供依據(jù)，作者對黃皮植株地上部位黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的含量進(jìn)行測定，并測定該化合物對稗草生理生化代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

稗草（E.crusgalli L.）屬禾本科，稗屬。種子采于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場，置于冰箱內(nèi)4℃保藏備用。

黃皮素內(nèi)酯Ⅱ：黃皮的果核、枝葉和花分別采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理室標(biāo)本園，在花期采集枝葉和花，成熟期采集種子，陰干后粉碎，用甲醇浸泡提取，m（粉碎物）∶V（甲醇）＝1∶3，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后得其粗提物，然后對粗提物進(jìn)行硅膠柱層析和薄層層析后，分離純化得白色結(jié)晶，經(jīng)核磁共振氫譜（1HNMR）（500MHz）和核磁共振碳譜（13CNMR）（125MHz）分析后，綜合以上特征并參考文獻(xiàn)報(bào)道鑒定為黃皮素內(nèi)酯Ⅱ（由中國科學(xué)院華南植物園魏孝義研究員進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定）。

圖1 黃皮素內(nèi)酯Ⅱ

1.2 黃皮素內(nèi)酯Ⅱ含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作：稱取黃皮素內(nèi)酯Ⅱ，用甲醇（100%）分別配制200、100、50、25μg／mL和12.5μg／mL的標(biāo)樣，過濾后經(jīng)HP－1100型高效液相色譜儀（美國惠普公司生產(chǎn)）進(jìn)行檢測，在212nm檢測各濃度的峰面積和出峰時(shí)間，重復(fù)3次，建立相應(yīng)的色譜條件。并以物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

色譜條件：色譜柱為HP Hypersi ODS C18250×4.0mm（i.d）5μm；柱溫：室溫；流動相：V（甲醇）∶V（水）＝75∶25；流速：1.0mL／min；檢測波長：212nm；進(jìn)樣量10μL；保留時(shí)間：約3.906min。

分別配制黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的濃度梯度，濃度分別為200、100、50、25、12.5μg／mL，在上述檢測條件下測定各濃度的峰面積，以其濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在儀器完全穩(wěn)定的狀態(tài)下，取一含量為98.52%黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

5mL濃度為100μg／mL黃皮素內(nèi)酯Ⅱ樣品溶液中，添加濃度為100μg／mL黃皮素內(nèi)酯Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品3、4、5、6、7、8mL，則添加的質(zhì)量分別是0.300、0.400、0.500、0.600、0.700mg和0.800mg，進(jìn)樣分析后，扣除樣品中原有的黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的含量，計(jì)算分析方法的準(zhǔn)確度。

含量的測定：分別稱取0.05g枝葉、花和果核的粗提物各3份，用10mL甲醇（100%）溶解，微孔濾膜（孔徑0.45μm）過濾后，采用上述液相色譜條件進(jìn)行檢測。

1.3 氨基酸總量的測定

參考山東農(nóng)業(yè)大學(xué)的方法［13]，稍加改進(jìn)。

藥劑的設(shè)計(jì)：稱取一定量的甲醇萃取物，用1mL N，N－二甲基甲酰胺和少量吐溫－80溶解后，加蒸餾水配成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL 5個(gè)濃度，以1mL N，N－二甲基甲酰胺和少量吐溫－80為對照。

稗草的培養(yǎng)（小杯法）：取25mL的小燒杯，往杯內(nèi)加入小玻璃珠，以鋪滿燒杯底部為宜，振動小燒杯使玻璃珠面達(dá)到平整，再往珠面上墊上一層新華牌定性濾紙，濾紙大小與杯口內(nèi)徑大小一致，選取發(fā)芽一致的稗草種子20粒，用鑷子均勻地放在濾紙上，燒杯內(nèi)加入5mL配制好的不同濃度的萃取物液，重復(fù)3次，放在光照培養(yǎng)箱中28℃恒溫下培養(yǎng)。10d后觀察結(jié)果。

氨基酸樣品提取液的制備：10d后取出各處理的稗草植株，用剪刀剪下葉片和根部，并將其剪成碎片（2mm左右）。迅速稱取樣品0.15g，重復(fù)3次，加入10mL蒸餾水，加熱至沸，冷卻后用單層濾紙過濾備用。

樣品氨基酸含量的測定：吸取上述樣品提取液1mL，加入1mL水合茚三酮溶液，在80℃恒溫水浴中加熱15min，取出后用pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋至10mL，在721型分光光度計(jì)610nm處測定吸光密度值，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。根據(jù)公式分別求出每克鮮樣品含氮量，根據(jù)公式計(jì)算含氮量比。

式中，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出每毫升提取液中氨基態(tài)氮含量（微克）；Vt為樣品提取液經(jīng)稀釋后的體積（mL）；L為測定時(shí)取樣品液毫升數(shù)；W 為樣品。

1.4 樣品蛋白含量的測定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，按照鄒琦［14]的方法進(jìn)行蛋白含量的測定：前處理方法同1.3，稱取稗草植株0.15g，重復(fù)3次。放入研缽中，加入1.5mL蒸餾水，研磨成勻漿，－4℃13 000r／min下冷凍離心15min。吸取上清液0.02mL放入具塞試管，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G－250溶液和0.98mL蒸餾水，在595nm下測定A值，查得蛋白含量。按公式計(jì)算樣品中的蛋白含量。

式中，C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值（μg）；Vt為提取液總體積（mL）；W 為樣品鮮重（g）；V1為測定時(shí)加樣量（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃皮素內(nèi)酯Ⅱ在黃皮不同組織中的含量測定

在給定的液相色譜檢測條件下測定各濃度的峰面積，以其濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的高效液相色譜工作曲線為y＝37.936x＋94.54，相關(guān)系數(shù)為R＝0.999 9。

在儀器完全穩(wěn)定的狀態(tài)下，取一含量為98.52%的樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差0.145 1，變異系數(shù)0.147 2%。

添加一定質(zhì)量的黃皮素內(nèi)酯Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析后，扣除樣品中原有的黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的含量，測定出回收率分別是98.49%、100.18%、99.68%、99.72%、100.09%和99.73%，平均回收率為99.65%。

分別配制黃皮的花、枝葉和果核的粗提物1 000μg／mL的濃度，在設(shè)定的檢測條件下測定各部分中化合物黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的含量，測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，黃皮素內(nèi)酯Ⅱ在花粗提物中的含量較少，僅為0.43%，在枝葉和果核中的含量分別為3.33%和3.21%。這說明黃皮素內(nèi)酯Ⅱ在黃皮枝葉和果核中的含量較高，且枝葉材料容易獲取，為從枝葉中提取黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的可行性提供了條件。本試驗(yàn)所用材料枝葉和花取于花期，果核取于成熟期，所以枝葉中黃皮素內(nèi)酯Ⅱ的含量較高是僅限于花期這個(gè)時(shí)期取樣的。

表1 化合物黃皮素內(nèi)酯Ⅱ在黃皮不同組織的含量1）

2.2 對稗草氨基酸代謝的影響

植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進(jìn)行運(yùn)輸，測定氨基酸總量是研究植物根系生長和整個(gè)生長發(fā)育的一個(gè)指標(biāo)。黃皮素內(nèi)酯Ⅱ在設(shè)定的0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL的濃度梯度下，對稗草植株中的氨基酸含量有一定的影響，樣品含氮量分別為1.402 8、1.317 2、1.250 2、1.128 7mg／g和0.903 2mg／g，比對照0.832 1mg／g均有所增加，且各處理與對照差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明黃皮素內(nèi)酯Ⅱ使稗草的氨基酸含量有一定的增加，氨基酸是合成蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)，而試驗(yàn)中觀察到處理稗草表現(xiàn)為頂端生長點(diǎn)鈍化、畸形，植株矮小，根部不發(fā)達(dá)，表現(xiàn)出營養(yǎng)供應(yīng)不足。分析原因可能是黃皮素內(nèi)酯Ⅱ阻礙了稗草氨基酸轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過程，使氨基酸在一定時(shí)期內(nèi)表現(xiàn)為積累。

表2 黃皮內(nèi)酯Ⅱ處理稗草氨基酸含量的變化

2.3 對稗草植株蛋白代謝的影響

分別設(shè)定0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL 5個(gè)濃度梯度處理稗草植株。結(jié)果表明，各處理稗草的蛋白含量與對照相比都有所下降，在處理濃度下，蛋白含量比對照分別降低75.91%、66.43%、62.43%、58.57%和58.03%。且各處理蛋白含量均與對照差異顯著。這一結(jié)果結(jié)合2.2中的結(jié)果表明黃皮素內(nèi)酯Ⅱ?qū)Π薏葜仓陜?nèi)氨基酸轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)有一定的影響，導(dǎo)致蛋白含量降低，從而影響到稗草的正常生長。

表3 黃皮素內(nèi)酯Ⅱ處理稗草蛋白含量的變化

3 討論

化學(xué)除草不僅造成環(huán)境污染，還會對作物或非靶標(biāo)生物產(chǎn)生藥害以及產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性問題。植物次生代謝物質(zhì)是生物間協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，易于在自然界循環(huán)中降解，而且次生代謝物質(zhì)具有多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，不容易產(chǎn)生抗性。因此，從自然界生物中尋找具有除草活性的化合物，已成為研發(fā)環(huán)境相容性除草劑的一條重要途徑。例如，除草劑環(huán)庚草醚（通用名為cinmethylin）是來源于植物性化合物1，4－桉樹腦；而捷利康公司開發(fā)的新型除草劑Triketones，則是來自植物的次級代謝產(chǎn)物L(fēng)eptospermone。天然產(chǎn)物不同尋常的結(jié)構(gòu)特征使其擁有與傳統(tǒng)除草劑不同的作用靶標(biāo)［15－16]。因此，對有植物毒性的天然產(chǎn)物進(jìn)行研究，有望發(fā)現(xiàn)具有新型作用機(jī)制的除草化合物，從而開發(fā)出新型安全的除草劑。

除草活性測定表明，黃皮植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物黃皮素內(nèi)酯Ⅱ?qū)Π薏萆L具有顯著抑制作用，經(jīng)過測定它主要分布在植物的枝葉內(nèi)，這為合理利用這種化合物提供了依據(jù)。黃皮素內(nèi)酯Ⅱ在國內(nèi)首次從該植物中分離，經(jīng)試驗(yàn)測定對稗草植株生長具有很好的抑制活性。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，經(jīng)黃皮素內(nèi)酯Ⅱ處理后，稗草植株內(nèi)的氨基酸含量升高，蛋白含量降低，這是稗草植株在受到刺激后，體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝受到干擾，很可能是黃皮素內(nèi)酯Ⅱ抑制稗草植物生長的作用機(jī)制之一，為尋找新的除草靶標(biāo)，開發(fā)新農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

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