易 龍， 賴曉樺， 盧占軍1，， 鐘八蓮

（1.贛南師范學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，贛州 341000；2.江西省臍橙工程技術(shù)研究中心，贛州 341000）

柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘上極具經(jīng)濟重要性的病害之一，嚴(yán)重影響著柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)，對柑橘生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。CTV主要通過蚜蟲和帶病接穗進行傳播，目前已經(jīng)毀滅了超過1億株的柑橘，并仍然嚴(yán)重威脅著世界上以酸橙作砧木的柑橘產(chǎn)區(qū)和對莖陷點型CTV敏感的柚類、葡萄柚和某些甜橙的安全［1]。

由于CTV在田間通過蚜蟲傳播，國外的防治經(jīng)驗表明，在CTV強毒株和有效傳媒橘蚜存在的種植區(qū)域，弱毒株交叉保護是最有效的防治措施［2－3]，而對其分離株的分析是應(yīng)用該技術(shù)的基礎(chǔ)［4]。江西贛南憑借其得天獨厚的適宜臍橙生長的環(huán)境條件，已成為種植面積世界第一的臍橙主產(chǎn)區(qū)［5]。在前期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)贛南臍橙上CTV感染率達44.9%［6]，給生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的威脅。目前針對江西贛南臍橙產(chǎn)區(qū)柑橘衰退病毒分離株的構(gòu)成情況尚缺乏全面調(diào)查，因此有必要對產(chǎn)區(qū)CTV分離株進行致病性鑒定，明確其組群構(gòu)成情況，尋找潛在的弱毒分離株，為今后江西柑橘衰退病的深入研究以及篩選弱毒株進行交叉保護防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

分別采自江西信豐、安遠(yuǎn)、尋烏、龍南、崇義等柑橘主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)直接組織點免疫法（DTBIA）［7]檢測呈陽性的209份樣品作為供試樣品。

1.2 樣品總核酸提取

按照周常勇等［8]的方法提取樣品總核酸。

1.3 外殼蛋白（CP）基因的擴增

參照Gillings等［9]的方法，由上海生工生物工程公司合成CTV外殼蛋白（CP）基因的特異性引物CP1（5′－ATGGACGACGAAACAAAG－3′）、CP3（5′－TCA－ACGTGTGTTGAATTT－3′），在Bio－Rad公司生產(chǎn)的 PTC－200型基因擴增儀進行反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）。PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用GoldView I染色后在Gel DocTMXR型凝膠成像系統(tǒng)上觀測。

1.4 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析

將PCR產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶HinfⅠ（TaKaRa產(chǎn)品）反應(yīng)體系相混合，37℃酶切1h，用3%超純瓊脂糖凝膠電泳后檢測酶切圖譜［9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTV CP基因的擴增

對樣品抽提的總核酸用CTV CP基因特異性引物進行RT－PCR擴增，209份樣品及陽性對照均能擴增出一個大小約672bp的DNA條帶（圖1），與已知CTV的CP基因大小相一致，陰性對照和水對照均不能擴增出該產(chǎn)物。

圖1 江西柑橘產(chǎn)區(qū)部分柑橘樣品CTV的RT－PCR擴增結(jié)果

2.2 CP／HinfⅠRFLP分析

根據(jù)Gillings等［9]的CTVCP／HinfⅠRFLP組群劃分標(biāo)準(zhǔn)，本試驗中209份樣品的CP／HinfⅠ酶切結(jié)果中182份樣品表現(xiàn)出單一CP／HinfⅠRFLP譜型，占鑒定樣品總數(shù)的87.1%，表明在本次試驗中檢測的江西柑橘樣品以CTV單一組群感染為主，主要分屬于CP／HinfⅠRFLP第3和第1組群（圖2）。

圖2 江西柑橘產(chǎn)區(qū)部分柑橘樣品CTV的CP／Hinf I RFLP酶切圖譜

進一步分析表明，在209份樣品中單一RFLP組群3、1分別占樣品總數(shù)的55.5%、26.8%，說明江西柑橘CTV分離株主要由CP／HinfⅠRFLP第3和第1組群構(gòu)成；同時有27個樣品含有多個RFLP組群，占樣品總數(shù)的12.9%，表明田間存在不同CTV分離株混合侵染的現(xiàn)象，其中以組群1和3混合發(fā)生為主，所有樣品中未檢出RFLP第2和第7組群的CTV分離株（表1）。檢測樣品中有1個分離株為第4組群，5個分離株為第5組群，初步判斷為潛在的弱毒株，有待進一步進行驗證。

表1 江西柑橘產(chǎn)區(qū)柑橘衰退病毒CP／HinfⅠRFLP組群構(gòu)成情況

3 討論

CTV為一種正義單鏈RNA病毒，具有較高的變異幾率，常由多個不同的分離株所組成［10]，給病害的鑒定和防治帶來了一定的難度，在生產(chǎn)上往往需要準(zhǔn)確、快速的方法對CTV的各個分離株進行鑒定和區(qū)別。CTV被分成具有不同生物學(xué)特性的7個CP／HinfⅠRFLP組群，其中第4組群和第5組群的分離株在指示植物上呈弱反應(yīng)，從中可以篩選具有潛在交叉保護作用的弱毒株；而其余組群中的分離株在指示植物表現(xiàn)出強致病性［9]。據(jù)此，國內(nèi)外廣泛運用CP／HinfⅠRFLP技術(shù)對CTV的CP基因進行限制性酶切，來快速準(zhǔn)確地對CTV分離株進行致病性鑒定［9，11－13]。

本研究結(jié)果表明在江西柑橘主產(chǎn)區(qū)CTV的CP／HinfⅠRFLP組群構(gòu)成以第3、1組群為主，其余組群發(fā)生較少，研究結(jié)果與Xu等［11]分析我國福建、重慶甜橙產(chǎn)區(qū)113個CTV分離株主要以CP／HinfⅠRFLP第3和1組群構(gòu)成結(jié)果相類似，但其研究結(jié)果田間以混合組群發(fā)生為主，而本研究中江西柑橘主產(chǎn)區(qū)CTV以單一組群構(gòu)成為主，可能是江西贛南大部分柑橘園中的樹齡不長，CTV感染的時間短，變異較少，加上果園中傳媒昆蟲少等原因而導(dǎo)致混合感染發(fā)生率低，存在差異的具體原因還有待進一步分析。另外本研究中分析的樣品RFLP組群圖譜總體符合Gillings［9]建立的CTV組群劃分標(biāo)準(zhǔn)，在今后江西柑橘產(chǎn)區(qū)田間大量樣品CTV分離株的快速鑒定中可運用此技術(shù)。

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