田 陽， 李 平， 張 莉， 孫建華＊， 高丙利

（1.天津師范大學生命科學學院，天津市細胞遺傳與分子調控重點實驗室，天津 300387；2.浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000）

植物寄生線蟲的分布非常廣泛，其種類已達200多屬5 000多種，每一種植物至少被一種線蟲寄生［1]。植物寄生線蟲對農業(yè)生產危害嚴重，全世界每年因線蟲危害給糧食和纖維作物造成的損失約為12.7%，對蔬菜、花生、煙草和果樹造成的損失超過20%，直接經濟損失達780億美元［2]。根結線蟲、大豆孢囊線蟲和松材線蟲是農林生產中危害十分嚴重的植物寄生線蟲，目前已成為農林生產上的重要病原物［3]，其中根結線蟲感染一般可造成作物產量損失10%～20%，高的達70%以上［4]。近年來，利用生物防治技術控制線蟲病害成為國際研究的熱點。生防微生物的應用是防治植物寄生線蟲病的重要手段，是保護生態(tài)環(huán)境，實現農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保證［5－7]。

在線蟲的生物防治中，抗生素的應用是較為有效的防治途徑之一。放線菌是抗生素的重要來源之一，其在自然界中廣泛分布于各種不同的自然生態(tài)環(huán)境里，種類繁多、代謝功能各異，是一類有著廣泛實際用途的生物資源［6]。1993年美國Willian Fenical［8]首先提出海洋微生物是一個新的化學研究資源，將成為新的研究熱點。海洋放線菌產生的抗生素，不僅結構新穎而且活性代謝產物也是最多的，其中90%以上的海洋放線菌活性產物來自于鏈霉菌屬，僅有少量的來自于放線菌的其他菌屬［9]。利用海洋放線菌的代謝產物控制線蟲病害成為防治植物線蟲病的重要發(fā)展方向［10]。目前有很多利用海洋真菌代謝產物殺線的報道，但殺線蟲種類單一［11]。利用海洋放線菌代謝產物防治線蟲的報道不多，本研究是利用海洋放線菌代謝產物對多種植物寄生線蟲進行研究，對于有效利用海洋放線菌具有一定的意義。

海洋放線菌M1D14是課題組篩選出的具有較高殺線蟲活性的生防菌株。本試驗著重對其進行殺線蟲譜研究并初步對其殺線蟲機理進行探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

海洋放線菌M1D14菌株由浙江東奇生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）察 氏 培 養(yǎng) 基 標 準 配 置 為 NaNO32g／L，K2HPO41g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，KCl 0.5g／L，FeSO4·7H2O 0.01g／L，瓊脂15g／L，葡萄糖36g／L。

（2）YE培養(yǎng)基標準配置為酵母膏4g／L，麥芽精10g／L，葡萄糖4g／L，瓊脂3g／L。

（3）M8培養(yǎng)基標準配置為可溶性淀粉20g／L，葡萄糖10g／L，酵母膏2g／L，酪蛋白水解物4g／L，牛肉膏2g／L，CaCO33g／L。

1.1.3 供試線蟲

（1）松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus），由天津師范大學提供。

（2）南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）2齡幼蟲，由浙江東奇生物科技有限公司提供。

（3）大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）2齡幼蟲，由浙江東奇生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 海洋放線菌菌株的獲得及發(fā)酵液制備

（1）海洋放線菌菌株M1D14的純化：將保藏的菌種畫線轉接至平板上，28℃，培養(yǎng)5～7d。

（2）海洋放線菌菌株M1D14的種子培養(yǎng)：挑取純化菌株至YE種子培養(yǎng)液中，28℃，200r／min，振蕩培養(yǎng)3d。

（3）海洋放線菌菌株M1D14的發(fā)酵培養(yǎng)：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液按1∶10比例轉接至M8培養(yǎng)液中，28℃，200r／min，振蕩培養(yǎng)7d。將發(fā)酵液用甲醇萃取，旋轉蒸發(fā)濃縮后，放入－10℃冰箱保存。

1.2.2 南方根結線蟲卵懸液的制備

采用改良的振蕩法分離法［12－13]。取溫室里接種南方根結線蟲60d后的番茄的根，將根剪成1～2cm的小段；放于200mL 1%的次氯酸鈉溶液中，在豆?jié){機中攪拌剪切1～4min；將懸浮液快速經100目、300目和500目的網篩，上下振蕩網篩，在500目的網篩上即可收集到游離的卵；隨即快速用無菌水沖洗500目篩網上的卵，以除去殘留的次氯酸鈉；再次沖洗振蕩根段以獲取更多的卵，用過篩法收集到離心管中，在底部加入40%蔗糖溶液20mL梯度離心，3 500r／min，5min，吸取界面溶液過500目篩，用水沖洗篩子去除蔗糖，反向將卵沖入三角瓶中。加水制成卵懸液，置于4℃冰箱中備用。

1.2.3 供試線蟲的制備

（1）南方根結線蟲2齡幼蟲（J2）的制備：將上述南方根結線蟲卵懸液置于自制孵化器中，加無菌水放置在25～28℃環(huán)境條件下孵化；4d左右會孵出大量的J2，收集到滅菌三角瓶中，置于4℃冰箱中備用。

（2）松材線蟲幼蟲的制備：在無菌操作條件下，將灰葡萄孢（Botrytis cinerea）接種于察氏培養(yǎng)基上，21℃下避光培養(yǎng)7d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，將松材線蟲接種于該菌絲上進行培養(yǎng)繁殖，26℃下避光培養(yǎng)5～7d［14]。通過貝爾曼漏斗法收集松材線蟲［15]，無菌水離心洗滌3次，2 000r／min離心3次，每次3min。用無菌水將離心得到的松材線蟲稀釋為1 000頭／mL的懸液備用。

（3）大豆孢囊線蟲J2的制備：將大豆品種‘黑60’種植在溫室的病原土壤中，孢囊成熟后挖出根系和根系周圍土壤，用過篩法［1]分離孢囊，選取新鮮飽滿成熟的褐色孢囊放在自制孵化池中用0.5%次氯酸鈉溶液消毒3min，再用無菌水沖洗3遍，加入自制孵化池中，在25℃4mmol／L ZnCl2溶液中孵化。4d左右會孵化出大量的J2，收集至滅菌的三角瓶中，置于4℃冰箱備用。

1.2.4 M1D14殺線活性測定

1.2.4.1 不同濃度放線菌M1D14菌株發(fā)酵液對不同線蟲J2的影響

采用梯度稀釋法［16]，在滅菌的96孔細胞培養(yǎng)皿中加入50μL不同濃度的M1D14菌株發(fā)酵液，以無菌水為陰性對照，5μg／mL阿維菌素和苯線磷為陽性對照，分別向處理和對照中加入50μL濃度為1 000條／mL的線蟲，4次重復，放入25℃培養(yǎng)箱中，24h后記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率［17－19]，線蟲死活判斷采用NaOH刺激法［20]。

下同。

1.2.4.2 不同處理放線菌M1D14發(fā)酵液對南方根結線蟲J2的影響

在滅菌的96孔細胞培養(yǎng)皿中分別加入50μL經過高溫高壓滅菌、0.22μm微孔濾膜過濾和未滅菌處理的不同濃度M1D14菌株發(fā)酵液，以無菌水為陰性對照，分別向處理和對照中加入50μL濃度為1 000條／mL南方根結線蟲J2，4次重復，放入25℃培養(yǎng)箱中，24h后記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率，線蟲死活判斷采用NaOH刺激法。

1.2.4.3 0.22μm微孔濾膜過濾的 M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結線蟲卵孵化的影響

在滅菌的24孔細胞培養(yǎng)皿中加入100μL 0.22μm微孔濾膜過濾的不同處理濃度的 M1D14菌株發(fā)酵液，以無菌水為陰性對照，5μg／mL苯線磷和阿維菌素為陽性對照，分別向處理和對照中加入經過10%NaClO消毒的100μL濃度為2 000個／mL南方根結線蟲卵，4次重復，放入25℃培養(yǎng)箱中，10d后記錄卵的孵化率［21]。

孵化率＝（線蟲孵化數／總卵數）×100%。

1.3 數據分析

所得數據經SPSS17.0軟件進行數據處理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 放線菌M1D14菌株發(fā)酵液對3種線蟲活性的影響

從表1結果可見，M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲幼蟲均有較好的抑制作用，對南方根結線蟲抑制效果最好、其次是松材線蟲，對大豆孢囊線蟲效果最差。M1D14菌株4倍發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲、南方根結線蟲、松材線蟲的致死率均可達到100%；稀釋16倍后，對南方根結線蟲、松材線蟲的致死率仍為100%，但對大豆孢囊線蟲致死率顯著下降，僅為19.67%。菌株發(fā)酵液對南方根結線蟲的抑制作用明顯高于對松材線蟲的抑制作用，在稀釋36倍后，對南方根結線蟲的致死率在80%以上，但對松材線蟲的致死率低于10%。

表1 不同濃度發(fā)酵液處理24h對3種線蟲幼蟲的毒力1）

2.2 放線菌M1D14菌株不同處理發(fā)酵液對南方根結線蟲J2的影響

從表2結果可知，經過高溫高壓滅菌和0.22μm微孔濾膜過濾的菌株發(fā)酵液對南方根結線蟲均有較好的抑制作用，在稀釋16倍時，高溫高壓滅菌和微孔濾膜過濾對菌株的活性沒有顯著影響，但稀釋24倍后，微孔濾膜過濾的發(fā)酵液活性顯著高于高溫高壓滅菌處理的發(fā)酵液活性，顯著低于未經滅菌處理的對照組活性。

表2 不同濃度發(fā)酵液處理24h對南方根結線蟲幼蟲的毒力1）

2.3 0.22μm微孔濾膜過濾的放線菌M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結線蟲卵孵化的影響

從表3結果可見，M1D14菌株發(fā)酵液不同處理對南方根結線蟲卵孵化無明顯差異，其作用效果與無菌水相當，略低于苯線磷和阿維菌素，沒有表現出對南方根結線蟲卵孵化的抑制作用。

2.4 M1D14發(fā)酵液與對照藥劑阿維菌素和苯線磷殺線活性比較

由表4結果可知，M1D14菌株4倍稀釋發(fā)酵液對南方根結線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲的致死率都為100%；5μg／mL阿維菌素對南方根結線蟲致死率達100%，對松材線蟲致死率為83.36%，對大豆孢囊線蟲致死率為100%；5μg／mL苯線磷對南方根結線蟲致死率達100%，對松材線蟲致死率為23.6 8%，對大豆孢囊線蟲致死率為1 0 0%。M1D14菌株4倍發(fā)酵液對3種線蟲都有很強的抑制作用，優(yōu)于5μg／mL阿維菌素或苯線磷的抑制作用。

表3 不同濃度菌株發(fā)酵液過濾處理后對南方根結線蟲卵孵化的影響

表4 M1D14及對照藥劑對3種線蟲J2的毒力1）

3 討論

由于放線菌菌株發(fā)酵液活性成分復雜，不同成分對不同線蟲的活性位點作用也不盡相同，所以同一菌株的發(fā)酵液對不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。M1D14菌株經過高溫高壓滅菌發(fā)酵液對南方根結線蟲J2活性仍有很大的毒力，說明該菌株發(fā)酵液殺線物質耐高溫；經過0.22μm微孔濾膜的發(fā)酵液對南方根結線蟲J2仍有毒力，說明有效成分不是菌體本身，而是其代謝產物。M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結線蟲卵孵化沒有抑制作用，但是對南方根結線蟲J2具有強毒力，說明M1D14對南方根結線蟲的作用機理可能是觸殺作用，具體機理尚在進一步的研究中。該菌株不同處理的發(fā)酵液與報道的其他生防菌株相比，使用濃度低，節(jié)約了生產成本，使其具有很好的應用前景［4]。

菌株發(fā)酵液對于3種不同線蟲J2的毒力作用與對照藥劑苯線磷或阿維菌素作用相當。由于苯線磷為化學藥物，對環(huán)境有極大的影響，已被列為禁用農藥；阿維菌素容易產生耐藥性、對于不同線蟲作用有差異［22－23]。而該菌株發(fā)酵液對3種線蟲J2都有很強的抑制作用，與對照藥劑相比具有對環(huán)境危害小、殺線蟲種類多、不易產生耐藥性的優(yōu)勢，開發(fā)前景廣大。

高濃度海洋放線菌M1D14發(fā)酵液對3種重要植物寄生線蟲都有很強的抑制作用，是一株具有廣泛應用前景的生物防治菌株。特別是M1D14發(fā)酵液對南方根結線蟲具有很強的殺線蟲活性，如果應用于生產，將對我國北方地區(qū)大棚蔬菜根結線蟲的防治產生重大影響。對該菌代謝產物中活性物質的分離純化及安全性評價正在系統(tǒng)深入研究。

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