金士威，程巧紅， 戴和平

(1．武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074；2. 中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，湖北 武漢 430072)

0 引 言

酵母是最簡單的高等真核生物，是真核生物研究的模式生物.酵母在三個不同水平上調(diào)節(jié)遺傳毒性化學物在細胞內(nèi)的累積：細胞壁、細胞膜的通透性以及細胞的多藥抗性機制(PDR途徑)[12].CWP1，CWP2基因編碼細胞壁苷露糖蛋白，失活可明顯提高酵母細胞壁通透性；SNQ1，SNQ2基因編碼外排泵蛋白，失活可明顯提高酵母內(nèi)檢測系統(tǒng)對不同分子量化學物的靈敏度；YAP1基因調(diào)控許多關鍵抗氧化基因的表達，失活可明顯提高酵母檢測系統(tǒng)檢測DNA氧化損傷劑的能力[13].

由于全氟化合物的廣泛使用和全球的普遍污染，越來越多的學者開始研究其在環(huán)境中的污染現(xiàn)狀、致毒機理和對人體的健康威脅.采用基于細胞培養(yǎng)的離體生物方法評估環(huán)境污染物的毒理學效應，相比于魚類、白鼠等活體動物實驗，具有成本低、時間短、靈敏度高等優(yōu)點，因此具有廣闊的應用前景.酵母細胞屬于單細胞生物，除了缺乏哺乳動物細胞復雜的受體系統(tǒng)外[14]，還具有易培養(yǎng)、生長快、價格低等優(yōu)點.本研究旨在篩選基因缺失型酵母來檢測環(huán)境中的有毒污染物，以PFOA為污染物模型，探究其對不同缺失型酵母的毒性機理.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

本實驗PFOA為純度大于97%的固體，購買自Merck公司，標準儲備液為1.0 mol/L，溶劑為二甲基亞砜(DMSO)、SD-Ura培養(yǎng)液.

SD-Ura培養(yǎng)液：酵母氮源無氨基無硫酸銨0.17%、硫酸銨 0.5%、腺嘌呤 0.2%、色氨酸 1%、組氨酸1%、亮氨酸1%、賴氨酸1%(以上百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)).

固體培養(yǎng)基加質(zhì)量分數(shù)2%的瓊脂粉，溶于蒸餾水中高壓滅菌后，加入質(zhì)量分數(shù)40%的葡萄糖致最終質(zhì)量分數(shù)為2%.

1.2 實驗器材

高壓滅菌鍋(LDZX-30KBS)，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn).搖床(THZ-C)，江蘇太倉實驗設備廠生產(chǎn).恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司生產(chǎn).超凈工作臺(Ai Tech)，蘇州安泰空氣技術有限公司生產(chǎn).移液槍(eppendorf)、?90 mm培養(yǎng)皿、試管、三角瓶.

1.3 實驗生物

本研究野生型酵母細胞BY4741和其4基因缺失型突變體(cwp1△cwp2△snq1△snq2△)、5基因缺失型突變體(cwp1△cwp2△snq1△snq2△yap1△)菌株均來自于中科院水生生物究所水生動物蛋白質(zhì)工程學科組.

1.4 實驗方法

實驗前均將配制的SD-Ura培養(yǎng)液在高壓滅菌鍋中滅菌，把三種酵母(BY4741、4基因缺失型突變體、5基因缺失型突變體)接種到SD-Ura液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min搖床過夜培養(yǎng)16 h.第二天用SD-Ura液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)的酵母培養(yǎng)液稀釋，分光光度計檢測其OD值為0.11，繼續(xù)30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)2 h，測其OD值為0.14時開始染毒.染毒后的酵母培養(yǎng)液繼續(xù)30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)4 h.取出酵母細胞培養(yǎng)液在超凈工作臺用無菌水稀釋105倍后，取100 uL涂SD-Ura固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，對長出的單克隆子進行統(tǒng)計計數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 DMSO溶劑對酵母生長的影響

生物實驗常以DMSO為污染物的載體溶劑，本實驗探索了不同的DMSO濃度對酵母生長的影響.由實驗結(jié)果得知，當DMSO在培養(yǎng)液中的質(zhì)量分數(shù)小于0.5%時，對3類酵母細胞的生長沒有明顯影響；而當DMSO質(zhì)量分數(shù)為5%時，則產(chǎn)生明顯的影響，特別是對5基因缺失型酵母突變體，影響更為顯著，其存活率降為70%.故以后的實驗中，培養(yǎng)液中DMSO的濃度不超過0.5%，以避免溶劑的影響.

2.2 染毒后酵母的培養(yǎng)時間與細胞生長量的關系

為了驗證酵母細胞染毒后細胞生長量與培養(yǎng)時間的最佳關系，酵母細胞培養(yǎng)液在染毒后分別在30 ℃，200 r/min搖床分別培養(yǎng)0、2、4、6、8 h，隨后分別在超凈工作臺用無菌水稀釋105倍，分別取100 uL涂SD-ura固體培養(yǎng)基平板后，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天后，對生長出的單克隆子計數(shù)，其結(jié)果如圖1所示.染毒超過4 h后，酵母增殖上處于不增殖的狀態(tài)，所以本實驗酵母細胞培養(yǎng)液染毒后繼續(xù)培養(yǎng)的時間定為4 h.

圖1 酵母培養(yǎng)時間與酵母生長量的關系Fig.1 Effect of culture time on the growth of yeast

2.3 PFOA濃度對酵母生長的影響

酵母細胞培養(yǎng)液加PFOA后，30 ℃，200 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在超凈工作臺用無菌水稀釋105倍后涂SD-Ura固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，對生長出的單克隆子計數(shù)，其結(jié)果如圖2.由圖2知，當PFOA濃度為0.6 mmol/L時，野生型酵母、4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體存活率分別為77.4%、69.7%和50.5%；當PFOA 濃度為1.2 mmol/L時，野生型酵母、4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體存活率分別為35.4%、15.2%、8.0%，4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體的存活率下降比較快；而當PFOA濃度大于1.2 mmol/L時，野生型、4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體存活率都為零(圖中未顯示).與野生型酵母相比，PFOA對4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體生長影響比較明顯，而對5基因缺失型酵母突變體生長影響尤其明顯.

圖2 PFOA對酵母毒性實驗(n=4)Fig.2 Effect of the concentration of PFOA on the growth of yeast

由以上實驗結(jié)果可知，PFOA對4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體的影響比野生型酵母細胞靈敏，可能因為4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體都缺失了編碼細胞壁苷露糖和細胞外排泵蛋白的基因，從而對外界毒物抗性的抵御機制減少很多，能很靈敏的感受到外界環(huán)境的壓力；而5基因缺失型酵母突變體比4基因缺失型酵母突變體又少了能調(diào)控許多關鍵抗氧化基因的表達的YAP1基因[12]，缺失了YAP1基因的5基因缺失型酵母突變體比4基因缺失型突變體對PFOA的靈敏性更強，說明5基因缺失型酵母突變體受到外界環(huán)境壓力的時候不能有效的防御細胞的氧化損傷.

綜上，當缺失了編碼細胞壁苷露糖和細胞外排泵蛋白的基因的酵母受到外界環(huán)境的壓力或者毒物的脅迫時，毒物可能以分子的形式從細胞壁進入細胞[15]，損害細胞的正常生理功能，進而致使酵母產(chǎn)生氧化損傷[13].

參考文獻：

[1] 范英武, 郎朗, 季宇彬. 全氟辛酸毒性的研究現(xiàn)狀[J]. 食品與藥品, 2008, 10(7): 66-69.

[2] 賀志麗, 賀志霞, 陳瑞琴. 改性活性炭對水溶液中氟離子的吸附性能[J]. 武漢工程大學學報, 2012, 34(1): 43-47.

[3] 韓建, 方展強 .水環(huán)境PFOS和PFOA的污染現(xiàn)狀及毒理效應進展[J]. 水生態(tài)學雜志, 2010, 3(2): 99-105.

[4] 劉健, 王海雁, 趙淑江. 全氟辛烷磺?；衔?PFOS)類物質(zhì)水環(huán)境污染研究進展[J]. 海洋環(huán)境科學, 2011, 30(3): 451-456.

[5] Han X, Ermper K A, Jepson G W. Subcellular distribution and protein binding of perfluorooctanoic acid in rat liver and kidney [J]. Drug Chem Toxicol, 2005, 28(2): 197-209.

[6] 范軼歐, 金一和, 麻懿馨，等. 全氟辛烷磺酸對雄性大鼠生精功能的影響[J]. 衛(wèi)生研究, 2005, 34 (1): 37-39 .

[7] 胡存麗, 仲來福. 全氟辛烷磺酸和全氟辛酸毒理學研究進展[J]. 中國工業(yè)醫(yī)學雜志, 2006, 19(6): 354-358.

[8] 姚曉峰, 仲來福. 全氟辛酸對HepG2細胞的遺傳毒性及氧化性DNA損傷[J]. 毒性學雜志, 2005, 19(3): 216-217.

[9] Lau C, Thibodeaux J R,Hanson R G, et al. Exposure to perfluorooctane sulfonate during pregnancy in rat and mouse.Ⅱ.Postnatal evaluation [J].Toxicological Sciences, 2003, 74: 382-392.

[10] Fenton S E,Reiner J L,Nakayama S E, et a1. Analysis of PFOA in dosed CD-1 mice．Part 2.Disposition of PFOA in tissues and fluids from pregnant and lactating mice and their pups[J]. Report Toxicol, 2009, 27(3-4): 365-372.

[11] Shix, Du Y, Lam P. Developmental toxicity and alte-ration of gene expression in zebra fish embryos exposed to PFOS[J]. Toxicological Sciences, 2008, 230(1): 23-32.

[12] Nguyen D T, Alarco A M ， Raymond M. Multiple Yap 1 binding sites mediate induction of the yeast major facilitator FLR1 gene in response to drugs, oxidants and alkylating agents [J]. J Biol Chem. 2009, 276: 1138-1145.

[13] Min Zhang, Chao Zhang, Jia Li. Inactivation of YAP1 Enhances Sensitivity of the Yeast RNR3-lacZ Genotoxicity Testing System to a Broad Range of DNA-Damaging Agents[J]. Toxicological Sciences, 2011, 120(2): 310-321.

[14] Jork J A B, Butenhoff J L, Wallace K B. Multiplicity of nuclear receptor activation by PFOA and PFOS in primary human and rodent hepatocytess[J]. Toxico-logy, 2011,288:8-17.

[15] 汪琨, 徐崢, 汪倩雯，等. 肉桂醛特異性抑制酵母細胞壁合成的作用機理[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(3): 68-72.

[16] 孫學志,金軍, 王英. 全氟辛烷磺化物及其環(huán)境問題[J]. 環(huán)境污染與防治, 2007, 3(29): 216-220.

[17] Yamada H, Taylor P H, Buck R C, et al. Thermal degradation of fluorotelomer treated articles and related materials[J]. Chemosphere, 2005,61(7):974-984.

[18] Nobuyoshi Y, Kurunthachalan K, Sachi T, et al. A global survey of perfluorinated acids in oceans[J]. Environ Sci Tec hnol, 2005, 50: 658-668.

[19] Kannan K, Corsolini S, Falandysz J, et al. Perfluor-ooctane sulfonate and Related Fluorinated Hydroca-rbons in Marine Mammals, Fishes and Birds from Coasts of the Baltic and the Mediterranean Seas[J]. Environ Sci Technol, 2002, 36(3): 210-216.

[20] Ehresman D J, Froehlich J W, Olsen G W, et al. Comparison of human whole blood, plasma and serum matrices for the determination of perfluorooctane sulfonate (PFOS), perfluorooctanoate (PFOA)[J]. Environ Res, 2007, 103(2): 176-184.

[21] Moriwaki H, Takatah Y, Arakawa R. Concentrations of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluoroo-ctanoic acid (PFOA) in vacuum cleaner dust collected in Japanese homes[J]. Environ Monit, 2003, 5: 753-757.