張麗蕊,閻翠蘭,王玉潯,蔣艷茹,王會(huì)還,孫瑞軍,閆紅,安雅臣

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血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在火針治療褥瘡小鼠創(chuàng)面中的表達(dá)及作用

張麗蕊1,閻翠蘭1,王玉潯1,蔣艷茹2,王會(huì)還3,孫瑞軍1,閆紅1,安雅臣1

(1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院,唐山 063000;2.唐山市中醫(yī)院,唐山063000;3.河北聯(lián)合大學(xué)開灤醫(yī)院,唐山 063000)

探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在火針治療褥瘡小鼠創(chuàng)面中的表達(dá)與作用。清潔級(jí)健康雌性SD小鼠72只隨機(jī)分為對(duì)照組、紅外線組、普針組和火針組,建立小鼠褥瘡模型,分別于第2 d及治療后3、7、10、15 d取材病理檢測(cè),HE染色觀察組織學(xué)變化。通過免疫組化結(jié)合圖像分析等技術(shù),觀察各組小鼠創(chuàng)面肉芽組織中VEGF表達(dá)情況和微血管的數(shù)目(microvessel count,MVC)。經(jīng)單因素方差分析及兩兩比較,可以認(rèn)為火針組VEGF表達(dá)及微血管數(shù)目與對(duì)照組、普針組及紅外線組有差別(＜0.05,＜0.01),普針組與紅外組療效無差別(＞0.05)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在火針治療褥瘡小鼠創(chuàng)面中的表達(dá)明顯高于普針組、紅外線組及對(duì)照組。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;褥瘡;火針療法;小鼠

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子,它能引起血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)成分改變,誘導(dǎo)新生血管形成[1]。褥瘡也稱壓瘡,是局部組織長(zhǎng)期受壓,血液循環(huán)障礙,持續(xù)缺血缺氧,營(yíng)養(yǎng)不良而形成組織壞死的壓力性潰瘍。褥瘡好發(fā)于昏迷、癱瘓、骨折等長(zhǎng)期臥床病人的受壓及摩擦部位,如尾骶部、股骨大轉(zhuǎn)子、外踝等骨骼突出之處,因血虛氣少,易潰爛。正如張介賓所說“用火先赤其針而后刺之,不但暖也,寒毒固結(jié),非此不可?！被疳槥楦邷毓ぞ?是針和灸的結(jié)合體,具備針刺的機(jī)械性刺激和艾灸火熱灼傷的溫暖性刺激,使病灶逐漸變性、壞死、脫落,新生肉芽,長(zhǎng)肌,愈合,形成瘢痕,以起到化腐生新、溫通氣血、消散固結(jié)、疏通經(jīng)絡(luò)等作用,最后達(dá)到愈合目的。本研究通過建立小鼠褥瘡模型,探討VEGF在火針治療褥瘡小鼠創(chuàng)面中的表達(dá)與作用,為臨床火針治療褥瘡提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD小白鼠72只,體重(24.9±9.8)g,雌性未孕,由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

VEGF(bs-0279R)抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PV6001試劑盒等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗人、大鼠小鼠兔狗牛羊豬VEGF抗體(兔抗鼠,分別l:100、1:50稀釋),購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)和醫(yī)學(xué)圖像分析軟件購(gòu)自上海申藤信息技術(shù)有限公司;攝像機(jī)(型號(hào)MV-CP410)購(gòu)自Panasonic公司;光學(xué)顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司;BH2數(shù)碼相機(jī)購(gòu)自Nikon公司。針具為蘇州醫(yī)療用品廠有限公司產(chǎn)品,經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒一次性使用華佗牌無菌針灸針。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

小鼠經(jīng)編號(hào)稱重后,按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為火針組、普針組、紅外線組、對(duì)照組,每組18只。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～25℃,濕度45%～55%。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)裝置

由固定裝置、加壓裝置兩部分組成。固定裝置由木架與離心管組成(圖1)。

圖1 固定裝置

簡(jiǎn)易木架,一塊約100 cm×15 cm長(zhǎng)方形木板,兩端用兩塊短板立起用釘固定,兩短板上端兩邊用兩根與長(zhǎng)木板等長(zhǎng)的木條釘成框架,兩木條之間用短木條隔開,每個(gè)格子正好放入加壓裝置(塑料瓶)。小鼠固定裝置,用50 mL塑料離心管72只,底部開直徑約為±1.3 cm圓孔,令小鼠口鼻伸出管外,便于加壓期間呼吸進(jìn)食;管口處開約3 cm×0.6 cmU形口,拉出小鼠右腿暴露于管外以便加壓固定;管蓋在中心處開直徑約0.5 cm圓孔,令尾部伸出管外。為防止塑料管在木板上移動(dòng),在木板上做好固定槽,嵌入塑料管用膠帶紙固定,以便加壓重心穩(wěn)定。加壓裝置選用市售康師傅牌(600 mL裝礦物質(zhì)水)方形透明(防滾動(dòng))空塑料瓶72只。分別裝入特定重量物品,用木制瓶塞,旋入擰緊4 cm長(zhǎng)木螺絲,釘帽直徑8 mm,總重量47.85 g。加壓時(shí)將瓶倒立,使釘帽下壓在小鼠右腿大轉(zhuǎn)子骨尖上,為使重力加壓準(zhǔn)確穩(wěn)定,將塑料瓶固定在木架上。加壓部分通過倒立的鐵釘來完成,通過計(jì)算鐵釘?shù)酌娣e,進(jìn)而計(jì)算出木板上需加的重量,使小鼠大腿靠近膝關(guān)節(jié)處皮膚組織受到9.33 kPa的壓強(qiáng)[2-3]。

1.3 褥瘡模型創(chuàng)建及確認(rèn)

分別于小鼠右腿股骨大轉(zhuǎn)子處用8%硫化鈉脫毛,裝進(jìn)塑料管內(nèi),拉出右腿及尾巴蓋好蓋膠帶固定。再將管固定在固定裝置的木板槽內(nèi),令股骨大轉(zhuǎn)子脫毛處朝上對(duì)準(zhǔn)加壓裝置,開始加壓計(jì)時(shí),持續(xù)加壓12 h,間斷2次,每次1 h。總加壓時(shí)間10 h。解壓后各組受傷小鼠群養(yǎng)。

肉眼觀患處水腫嚴(yán)重,表皮青紫潰破滲出,下肢腫脹粗大,小腿及爪紅腫,關(guān)節(jié)不活動(dòng),拉腿爬行,符合3～4度褥瘡標(biāo)準(zhǔn)。模型建立48 h后,每組各取1只切取患處全層組織病理檢查,結(jié)果炎細(xì)胞浸潤(rùn),組織水腫,潰瘍壞死,確認(rèn)褥瘡模型創(chuàng)建成功。

1.4 各組治療及觀察項(xiàng)目

1.4.1 治療時(shí)間

褥瘡模型確認(rèn),解壓后第3 d開始治療,肉眼觀察病理檢測(cè)記錄治療后創(chuàng)面變化,15 d判斷效果。

1.4.2 火針治療方法

取瘡面及瘡周阿是穴數(shù)個(gè),常規(guī)消毒,選0.35 mm×11 mm普通毫針,在乙醇燈火上燒紅,快速刺至瘡面深層,針間距為0.3 cm,共治療1次。

1.4.3 普通針刺法

取瘡面周圍阿是穴4個(gè),常規(guī)消毒,選0.35 mm×25 mm普通毫針,雞爪刺至基底部各個(gè)方向,不留針,每日1次,連續(xù)治療5次。

1.4.4 遠(yuǎn)紅外線理療

將小鼠固定創(chuàng)面朝上,理療儀放置在距瘡面15 cm高度,每次照射30 min,每日1次,連續(xù)治療5次。

1.4.5 VEGF表達(dá)和微血管數(shù)目的觀察

觀察各組小鼠創(chuàng)面肉芽組織中VEGF表達(dá)情況和微血管的數(shù)目。

1.5 病理檢測(cè)

于模型創(chuàng)建第2 d及治療后第3、7、10、15 d,分別活體取材病理檢查,取材后單籠喂養(yǎng),觀察存活率。取材部位為小鼠右腿股骨大轉(zhuǎn)子瘡面中心區(qū),呈縱切面切取1 cm×0.4 cm×0.6 cm片狀皮膚全層組織,經(jīng)HE染色制片鏡下觀察各組不同階段病理變化。

1.6 免疫組化操作流程

石蠟切片脫蠟至去離子水。采用枸櫞酸修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原高壓熱修復(fù)。修復(fù)后的切片自然冷卻至室溫。X-100室溫洗滌10 min。3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶,室溫10 min。PBS緩沖液洗滌3 min,共3次。滴加特異性抗體,孵育過夜。PBS緩沖液洗滌3 min,共3次。PV6001試劑盒中的試劑(抗兔抗體酶復(fù)合物)37℃孵育30 min。PBS緩沖液洗滌3 min,共3次。DAB鏡檢控制顯色。流水沖洗3 h以上,以去除DAB殘留物。蘇木素復(fù)染,脫水,透明封片。結(jié)果,陽(yáng)性部位于細(xì)胞漿,呈棕黃色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel2003建立數(shù)據(jù)庫(kù),采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間同一時(shí)間點(diǎn)及組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間比較采用單因素方差分析,以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以＜0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圖像分析法分析VEGF表達(dá)量

采用MV-CP410攝像機(jī)、IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng),通過顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機(jī)或CCD攝像機(jī)采集數(shù)字圖像。詳見圖2。

數(shù)字圖像為標(biāo)準(zhǔn)的BMP(位圖)文件格式;在100倍光學(xué)顯微鏡下,先點(diǎn)擊圖像微尺上的兩個(gè)點(diǎn),再將其實(shí)際微米數(shù)輸入計(jì)算機(jī),計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算得到比例因子后存儲(chǔ)備用;消除免疫組化圖像中的紫藍(lán)色背景,選擇陰性區(qū)域,處理后用藍(lán)色表示;選擇棕黃色或棕褐色陽(yáng)性區(qū)域,處理后用紅色表示;測(cè)定圖像中陽(yáng)性區(qū)域面積和陽(yáng)性比率以及光密度值,每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野,求出平均值,計(jì)算VEGF表達(dá)水平。詳見表1。

2.2 圖像分析法分析微血管數(shù)

每張石蠟切片,隨機(jī)選取肉芽組織區(qū)域的3個(gè)視野,求出3個(gè)視野的平均值,計(jì)數(shù)微血管的數(shù)目(microvessel count,MVC)。詳見表1。

表1 小鼠創(chuàng)面肉芽組織中VEGF表達(dá)情況和微血管的數(shù)目檢測(cè)結(jié)果 (±s)

注:與紅外線組、普針組比較1)＜0.01;與對(duì)照組比較2)＜0.05

經(jīng)單因素方差分析及兩兩比較,我們可以認(rèn)為火針組VEGF表達(dá)及微血管數(shù)目與對(duì)照組、普針組及紅外線組有差別(＜0.05,＜0.01),火針組明顯優(yōu)于其他三組;普針組與紅外組VEGF表達(dá)及微血管數(shù)目?jī)?yōu)于對(duì)照組,但二者之間無差別(＞0.05)。

3 討論

火針屬特殊針法,療效奇特,操作時(shí)間雖然快速短暫,但其后的良性調(diào)節(jié)及修復(fù)作用卻是漫長(zhǎng)的?？梢哉J(rèn)為,火針治療過程就是自身良性調(diào)節(jié)過程、新陳代謝過程、自行修復(fù)過程、免疫功能調(diào)節(jié)增強(qiáng)過程。事實(shí)上火針也是一種傷害性刺激,有意在病灶組織上造成新的良性傷害,可調(diào)動(dòng)自身一切可能的調(diào)節(jié)手段和機(jī)能,使體內(nèi)許多生長(zhǎng)因子會(huì)在機(jī)體統(tǒng)一調(diào)控下積極而有序地參與創(chuàng)傷修復(fù),肉芽組織有序生長(zhǎng),血管再生[4]。實(shí)驗(yàn)證明火針有促進(jìn)病灶壞死、液化,激發(fā)自身良性調(diào)節(jié)機(jī)制,釋放VEGF等許多生長(zhǎng)因子作用,從而促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng),加速愈合?；疳樦委熑殳弰?chuàng)傷小,操作簡(jiǎn)便,治療時(shí)間短,無副反應(yīng),不利因素可降到最低限度,有助于整體康復(fù),值得臨床推廣應(yīng)用。

[1] 繆玉蘭,汪虹.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用及其在燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的意義[J].中華燒傷雜志,2006,22(6):478-480.

[2] 姜麗萍,蔡福滿,楊曄琴,等.局部皮膚持續(xù)受壓致壓瘡的實(shí)驗(yàn)研究[J].解放軍護(hù)理雜志,2007,24(12A):4-5.

[3] 蔡福滿,姜麗萍,楊曄琴,等.皮膚壓瘡缺血再灌注損傷及其作用機(jī)制研究[J].護(hù)理研究,2006,20(6):1429-1431.

[4] 李巖,周震,賀小靖,等.火針治療痹癥的療效觀察[J].中國(guó)針灸, 2003,23(7):408-411.

Expression and Effect of Vascular Endothelial Growth Factor in the Wound Surface in Fire Acupuncture Treatment of Bedsore Mice

1,-1,-1,-2,-3,-1,1,-1.

1.,063000,; 2.,063000,; 3.,063000,

To investigate the expression and effect of vascular endothelial growth factor (VEGF) in fire acupuncture treatment for the wound surface in bedsore mice.Seventy-two clean-class healthy female SD mice were randomly assigned to control, far-infrared, conventional acupuncture and fire acupuncture groups. A mouse model of bedsore was made. The tissue was taken for a pathological examination at the second day, and 3, 7, 10 and 15 days after treatment. Histological changes were observed by HE staining. VEGF expression and microvessel count (MVC) in the granulation tissue of wound surface were observed by an immunohistochemical method and image analysis in various groups of mice.It showed by one-way ANOVA and pairwise comparison that, the expression of VEGF and MVC in fire acupuncture group were significantly different from those in conventional acupuncture group and far-infrared group (＜0.05,＜0.01), and the difference in therapeutic efficacy between conventional acupuncture and far-infrared groups was insignificant (＞0.05).The expression of vascular endothelial growth factor in the wound surface is significantly higher in the fire acupuncture group of bedsore mice than in the conventional acupuncture, far-infrared and control groups.

Vascular endothelial growth factor; Bedsore; Fire acupuncture therapy; Mice

1005-0957(2012)08-0606-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.08.606

2012-03-20

河北省科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃(2008134)

張麗蕊(1970 - ),女,副主任醫(yī)師,碩士

安雅臣(1977 - ),男,主治醫(yī)師,碩士,Email:anyachen007@ 126.com