趙 燕 趙建元， 楊曙明 魏 濤

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100083）

咪達(dá)唑侖（midazolam）是臨床常用的含咪唑環(huán)的苯二氮草類藥物，具有抗焦慮、驚厥、肌肉松弛、順序性遺忘以及催眠的作用，目前廣泛應(yīng)用于麻醉領(lǐng)域[1]。另外，咪達(dá)唑侖具有脂溶性高，半衰期短的特點(diǎn)[2－5]。咪達(dá)唑侖是一種鎮(zhèn)定安定劑，將其添加入飼料可以促使動(dòng)物入睡，從而產(chǎn)生促增重作用。由于咪達(dá)唑侖作為增重劑效果好，經(jīng)濟(jì)回報(bào)高，部分違法者在畜禽養(yǎng)殖過程中使用咪達(dá)唑侖作為飼料添加劑，導(dǎo)致咪達(dá)唑侖可能會(huì)殘留在各種食用組織中，人食用此類動(dòng)物產(chǎn)品后，會(huì)表現(xiàn)出惡心、嘔吐、頭暈無力等現(xiàn)象，過量中毒可出現(xiàn)昏迷、心跳過速等癥狀，人久吃則會(huì)產(chǎn)生耐藥性。我國農(nóng)業(yè)部第176號(hào)公告中指出，禁止在飼料中使用咪達(dá)唑侖，而我國尚未出臺(tái)有關(guān)飼料中咪達(dá)唑侖的檢測方法。因此，迫切需要通過系統(tǒng)的研究建立飼料中咪達(dá)唑侖的檢測方法，從而促進(jìn)飼料規(guī)范生產(chǎn)和科學(xué)利用，為促進(jìn)我國畜牧業(yè)發(fā)展，飼料產(chǎn)業(yè)提升提供技術(shù)支持。截止目前，關(guān)于飼料樣品中的咪達(dá)唑侖的檢測方法報(bào)道不多，尤其是用于飼料樣品中咪達(dá)唑侖殘留量測定的儀器分析確證方法鮮有報(bào)道[6]。國內(nèi)外有關(guān)咪達(dá)唑侖的研究不多，且多數(shù)集中在對(duì)血漿中的殘留測定方面，未涉及到飼料中咪達(dá)唑侖含量的測定[7－8]。本文建立了高效液相色譜法測定飼料中咪達(dá)唑侖含量的方法，操作簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬配合飼料、豬預(yù)混合飼料、豬濃縮飼料均取自國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京）。乙腈、甲醇為色譜純。水為Millipore超純水，標(biāo)準(zhǔn)品純度>99%，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為用甲醇配成的濃度為1 mg/ml的咪達(dá)唑侖，置于棕色瓶中在-80℃下保存。將儲(chǔ)備液用甲醇繼續(xù)稀釋，制成濃度為1、10 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，感量0.0001 g；垂直振蕩器；高速冷卻離心機(jī)；氮吹儀;旋渦混合儀；固相萃取柱（waters,C18-3cc-200 mg）；1 ml針頭過濾器（備有 0.45 μm 的微孔濾膜）；高效液相色譜儀（Waters2695，配有紫外檢測器2998）。

1.3 試樣的處理

1.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取1 g飼料樣品（配合飼料、預(yù)混合飼料及濃縮飼料），置于50 ml的聚丙烯離心管中，加入5 ml乙腈提取液，垂直振蕩10 min使其混勻，后于12000 r/min，4℃條件下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至10 ml聚丙烯離心管中。向試樣中再加入5 ml試樣提取液，重復(fù)提取1次。合并兩次上清液，40℃下將上清液用氮?dú)獯抵两桑? ml的甲醇漩渦振蕩溶解備用。

1.3.2 凈化

準(zhǔn)確移取上述飼料試樣各1 ml，再加2 ml水漩渦混勻。注入已用3 ml甲醇和3 ml水活化過的C18固相萃取小柱，然后用3 ml水淋洗，再用2 ml甲醇洗脫并收集洗脫液。洗脫液用氮?dú)獯抵两桑? ml甲醇漩渦混合溶解，過0.45 μm的微孔濾膜，濾液在HPLC上測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：溶劑A甲醇+溶劑B超純水；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30℃。流動(dòng)相梯度及洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果

2.1 校準(zhǔn)曲線

在已提取凈化好的飼料空白溶液中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在本實(shí)驗(yàn)確定的色譜條件下，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，按其所得峰面積(縱軸)與對(duì)應(yīng)的咪達(dá)唑侖濃度(橫軸)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程和相應(yīng)系數(shù)。試驗(yàn)測得咪達(dá)唑侖溶液濃度在1.00～10.00 μg/ml范圍內(nèi)線性良好：豬配合飼料線性回歸方程為Y=47558X-1469.5，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9976；預(yù)混合飼料線性回歸方程為Y=49293X-272.47，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9954；濃縮飼料線性回歸方程為Y=44482X-5867.4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9979。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1～圖3。

圖1 豬配合飼料標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 豬預(yù)混合飼料標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 豬濃縮飼料標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 定量限

依據(jù)液相色譜目標(biāo)峰信噪比S/N>10確定方向定量限，測得飼料中咪達(dá)唑侖的定量限為1.0 mg/kg。

2.3 方法加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)

采用在空白飼料樣品中添加目標(biāo)化合物的方法測得回收率,每種飼料平行測定3次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，測定結(jié)果見表2～表4。由表可知，在1.0 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)添加水平下，豬配合飼料回收率為70%～100%，豬預(yù)混合飼料回收率為60%～100%，豬濃縮飼料回收率為65%～100%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。重復(fù)性及再現(xiàn)性良好。

表2 豬配合飼料中咪達(dá)唑侖添加回收率結(jié)果(%)

表3 豬預(yù)混合飼料中咪達(dá)唑侖添加回收率結(jié)果(%)

表4 豬濃縮飼料中咪達(dá)唑侖添加回收率結(jié)果(%)

3 討論

3.1 前處理方法的確定

本標(biāo)準(zhǔn)用于測定飼料中咪達(dá)唑侖的含量，但飼料中復(fù)雜的基質(zhì)使得進(jìn)行液相色譜測定時(shí)干擾極大，因此在進(jìn)行檢測前選擇良好的前處理方法是十分必要的。

3.1.1 提取條件的確定

由于咪達(dá)唑侖易溶于乙腈、甲醇以及乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)嘗試用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙醇六種溶液提取飼料樣品中的咪達(dá)唑侖，并進(jìn)行高效液相色譜分析。結(jié)果表明，用正己烷、丙酮、乙醇提取時(shí)，提取效果不好；用乙酸乙酯提取時(shí)，雖回收率較高，但提取液在咪達(dá)唑侖出峰位置附近有很強(qiáng)的雜峰干擾，無法準(zhǔn)確定量；用甲醇提取時(shí)，雖與雜峰分開，但回收率較低。用乙腈提取時(shí)，咪達(dá)唑侖提取完全，回收率較高，雜峰干擾小，所以我們選擇乙腈為提取溶劑。乙酸乙酯提取色譜見圖4。

圖4 乙酸乙酯提取配合飼料空白、添加及標(biāo)準(zhǔn)品比較

3.1.2 凈化方法的確定

本方法采用固相萃取柱凈化樣品提取液。由于咪達(dá)唑侖極性較弱，選用C18柱和硅膠柱進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硅膠柱不能除去目標(biāo)峰附近的雜峰干擾，而C18柱的分離效果較好，且回收率高，因此最終確立采用C18柱對(duì)飼料提取液進(jìn)行固相萃取。

3.2 檢測波長的確定

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液在200～400 nm以1 nm間隔掃描，測得咪達(dá)唑侖的最大吸收波長為223 nm。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，223 nm波長處始終有雜峰干擾，無法去除。但此雜峰在254 nm波長時(shí)無紫外吸收，且分離良好。因此確定254 nm為最佳檢測波長。

3.3 液相色譜柱的確定

由于咪達(dá)唑侖極性較弱，試驗(yàn)中嘗試選用C18色譜柱進(jìn)行測定，但因飼料基質(zhì)中雜質(zhì)眾多不能在前處理中完全凈化，用150 mm的C18色譜柱檢測時(shí)分離度較低，干擾大，無法準(zhǔn)確定量；用250 mm的C18柱檢測時(shí)分離度明顯增強(qiáng)，因此選擇250 mm的C18柱進(jìn)行檢測。

3.4 流動(dòng)相比例及梯度的確定

C18色譜柱為反相柱，實(shí)驗(yàn)時(shí)一般采用水、甲醇、乙腈等強(qiáng)極性溶劑作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)表明咪達(dá)唑侖在甲醇的溶解度高，因此采用水+甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行測定。當(dāng)甲醇比例大于58%時(shí)，目標(biāo)峰出峰時(shí)間較早與雜峰分離度低；比例小于58%目標(biāo)峰與雜峰難以分離。因此選用58%甲醇+42%的水作為流動(dòng)相初始比例。又因在飼料提取過程中，乙腈提取出大量脂溶性雜質(zhì)，使得樣品中有大量殘留，無法被58%甲醇流動(dòng)相完全洗脫，為保證結(jié)果的穩(wěn)定性，延長色譜柱使用壽命。故在目標(biāo)峰保留時(shí)間之后將流動(dòng)相中甲醇比例變化為100%，以清洗色譜柱中殘留的大量脂溶性雜質(zhì)。圖5～圖10為確定色譜條件下3種飼料的空白及標(biāo)準(zhǔn)添加色譜圖。

圖5 豬配合飼料空白樣品色譜

圖6 豬配合飼料咪達(dá)唑侖添加色譜

圖7 豬預(yù)混合飼料空白樣品色譜

圖8 豬預(yù)混合飼料咪達(dá)唑侖添加色譜

圖9 豬濃縮飼料空白樣品色譜

圖10 豬濃縮飼料咪達(dá)唑侖添加色譜

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中所確立的檢測方法適用于豬配合飼料、豬預(yù)混合飼料、豬濃縮飼料中咪達(dá)唑侖含量的測定，通過對(duì)儀器色譜條件及前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，以及采用C18固相萃取柱對(duì)樣品提取液的凈化，使得方法的靈敏度、精確度均能滿足日常分析的要求，且具有檢測成本低，操作簡單，檢測效率高等特點(diǎn)。

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