馬 倩 趙衍銅 柏明娜 張小純 郭麗君 張福君 牛淑玲

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林省正方實(shí)業(yè)股份有限公司，吉林 梅河口 135000)

脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPs)是細(xì)胞內(nèi)一類小分子蛋白，能將脂肪酸運(yùn)輸?shù)街舅嵫趸透视腿セ蛄字铣傻牟课?。肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白 (liver fatty acid binding protein,L－FABP)是FABPs家族中的一員，主要表達(dá)于肝臟組織和小腸中，具有127個(gè)氨基酸殘基和2個(gè)脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)[1]。Wang等[2]研究表明,雞L－FABP基因可能是腹脂性狀的候選基因或與其主效基因連鎖。Huang[3]研究發(fā)現(xiàn)，L－FABP可以加強(qiáng)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)中鏈脂肪酸到細(xì)胞核，促進(jìn)脂肪酸與具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。研究表明血液中脂肪酸的濃度和激素水平可以影響L－FABP基因的表達(dá)。Ockner等[4]發(fā)現(xiàn)高脂飲食可以增加大鼠肝臟和小腸中L－FABP的含量。

近年來，維生素E在肥肝生產(chǎn)中的應(yīng)用受到了很多的關(guān)注，維生素E在肥肝形成中主要起到抗氧化作用。周敏[5]通過在櫻桃谷鴨的填飼飼料中添加90 IU/kg維生素E，顯著降低了料肝比，提高了肥肝重、評(píng)定等級(jí)，改善了肥肝的化學(xué)組成、感官品質(zhì)。

本試驗(yàn)在騾鴨的填飼日糧中添加不同水平的維生素E，利用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟組織中L－FABP mRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析維生素E對(duì)L－FABP基因表達(dá)的影響，同時(shí)進(jìn)一步探討該基因?qū)Ψ矢涡纬傻恼{(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

體重相近、健康的70日齡公騾鴨600只，由吉林省正方農(nóng)牧股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子設(shè)計(jì)方案，隨機(jī)分為4個(gè)處理組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)，每組 3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 50 只。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂填飼日糧，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為試驗(yàn)組，分別在填飼日糧基礎(chǔ)上添加40、90、140 mg/kg的維生素E。預(yù)飼期25 d，填飼期13 d。

1.3 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

預(yù)飼期日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，填飼日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。填飼飼料為流質(zhì)，飼料與水的比例為1： 0.8。

表1 預(yù)飼期日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

表2 填飼日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

預(yù)飼期以舍飼為主，適當(dāng)放牧為輔，自由采食全價(jià)混合飼料，補(bǔ)充大量?jī)?yōu)質(zhì)青飼料，鍛煉騾鴨食道的擴(kuò)張性能。鴨舍保持清潔干燥，采光良好，溫度適宜。

在填飼前做好相應(yīng)的疫苗接種和消毒工作。填飼期實(shí)行一對(duì)一籠養(yǎng)，自由飲水。每天填飼2次，時(shí)間分別為5:30和17:30。鴨舍通風(fēng)順暢，舍內(nèi)光線稍暗，周圍環(huán)境安靜，舍內(nèi)溫度保持在21～24℃。

1.5 樣品采集

于預(yù)飼期最后1 d（95日齡）和填飼結(jié)束時(shí)（108日齡），從各處理中隨機(jī)抽取12只騾鴨屠宰，采取適量肝臟組織，置于液氮冷凍保存。

1.6 肝臟L-FABP mRNA表達(dá)量的檢測(cè)

1.6.1 總RNA的提取

采用Trizol提取總RNA,主要步驟如下：①取50 mg肝臟組織于研缽加液氮研磨，將研碎的組織置于2 ml的離心管中，加入1 ml Trizol（Invitrogen），混勻，室溫靜置5 min。②往離心管中加入200 μl氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10 min。③4℃，12000×g離心18 min。④吸取上清液，加入500 μl異丙醇，輕微振蕩，室溫靜置 10 min。⑤4 ℃，12000×g離心10 min。⑥棄上清液，加入 1 ml、75%的冷乙醇，混勻。⑦ 4 ℃，7500×g離心5 min。⑧倒掉乙醇，室溫干燥至無色透明。⑨加入20 μl 0.1%DEPC水溶解RNA，-80℃保存。⑩用DNA/RNA Calculator儀器測(cè)定RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.6.2 cDNA的合成

取 1 μg總 RNA 按照 Bio RT Two Step RT-PCR kit（購(gòu)自杭州博日科技有限公司）操作說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-80℃保存。

1.6.3 引物的設(shè)計(jì)和合成

本研究采用鴨GAPDH基因?yàn)閰⒄栈?，根?jù)GenBank中查到的雞L-FABP基因序列（ID374015）和鴨GAPDH基因序列（AY436595），應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。兩對(duì)引物均由長(zhǎng)春華大中天生物技術(shù)有限公司合成。序列如下：

L-FABP-F：5'GCAGAATGGGAATAAGTT3'

L-FABP-R：5'TTGTATGGGTGATGGTGT3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為101 bp。

GAPDH-F：5'ACTGTCAAGGCTGAGAATGG3'

GAPDH-R：5'TAAGACCCTCCACAATGCC3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為90 bp。

1.6.4 L-FABP和GAPDH質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

選取4個(gè)樣品（每個(gè)處理一個(gè)）的cDNA為模板，分別制作L-FABP基因和GAPDH基因的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。具體步驟如下：①分別擴(kuò)增L-FABP基因和GAPDH 基因。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer，2 μl；dNTP Mixture(10 mM)，0.4 μl；上游引物(5 μM)，0.2 μl；下游引物(5 μM),0.2 μl；cDNA，2 μl；Taq 酶，0.4 μl；ddH2O,14.8 μl。反應(yīng)條件：L-FABP基因，94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，48 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min，35 個(gè)循環(huán)；GAPDH 基因，95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、40 s，72℃、10 min，35個(gè)循環(huán)。②利用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收純化。③將純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM－T載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。采用藍(lán)/白斑菌落篩選法鑒定陽性克隆。④提取質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序，應(yīng)用NCBI中的BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較。⑤將測(cè)序正確的L－FABP和GAPDH基因的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度的稀釋，分別稀釋到原質(zhì)粒濃度的100、101、102、103、104五個(gè)水平。

1.6.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

通過不同梯度進(jìn)行擴(kuò)增，得出最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為20.0 μl，具體如下：SYBR premix Ex TaqTM，10 μl；上游引物(10 μM)，1 μl；下游引物(10 μM)，1 μl；模板，2 μl；ddH2O，6 μl。反應(yīng)條件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，58 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。所有樣品的待測(cè)基因和內(nèi)參基因均照上述條件進(jìn)行。同時(shí)，選取不同稀釋水平的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR（與上述條件一致）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS16.0軟件的One－Way ANOVA進(jìn)行方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 L－FABP和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以得到的Ct值為縱坐標(biāo),稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1和圖2)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到L－FABP 和 GAPDH 基因的標(biāo)準(zhǔn)方程（L：y＝－3.716x＋26.864；G:y=－3.433x＋34）。

圖1 L－FABP標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 L－FABP和GAPDH基因的擴(kuò)增曲線

圖3 L－FABP擴(kuò)增曲線

圖4 GAPDH擴(kuò)增曲線

2.3 不同維生素E水平對(duì)騾鴨肝臟L－FABP mRNA表達(dá)量的影響

把每個(gè)樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，算出樣品的拷貝數(shù)。樣品L－FABP mRNA相對(duì)表達(dá)量=樣品L－FABP基因拷貝數(shù)/樣品GAPDH基因拷貝數(shù)。

由表3見：填飼結(jié)束后,與95日齡相比,騾鴨肝臟中 L－FABP mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；填飼結(jié)束后，各試驗(yàn)組肝臟中L－FABP mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；Ⅱ組肝臟中LFABP mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高，且與Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同維生素E水平對(duì)騾鴨肝臟L－FABP mRNA表達(dá)量的影響

3 討論

L－FABP是FABPs中的一員，對(duì)軟脂酸鹽、油酸和硬脂酸鹽等長(zhǎng)鏈脂肪酸具有高度親和力。在肝臟，長(zhǎng)鏈脂肪酸通常被肝細(xì)胞膜上的FABP攝取，進(jìn)入細(xì)胞，L-FABP將其轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器進(jìn)行β-氧化、酯化，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸代謝。肝細(xì)胞中L-FABP的含量受多種因素的影響。馮愛娟等[6]發(fā)現(xiàn)高脂飲食會(huì)使大鼠L-FABP表達(dá)增強(qiáng)，脂肪酸代謝失衡，引起脂肪肝的發(fā)生。徐國(guó)慶[7]研究表明L-FABP為鵝肥肝生產(chǎn)中的上調(diào)基因。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，填飼結(jié)束后，與填飼前相比，騾鴨肝臟中L-FABP mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，與上述報(bào)道一致。在填飼期間，騾鴨被飼喂大量富含碳水化合物的高能飼料，導(dǎo)致脂肪酸在肝細(xì)胞的大量合成并沉積，最終肝臟脂肪酸代謝失去平衡，發(fā)生組織學(xué)改變形成肥肝。為了適應(yīng)機(jī)體的變化，防止肝細(xì)胞內(nèi)大量游離脂肪酸的堆積引起細(xì)胞中毒，肝臟中L-FABP mRNA的表達(dá)量也相應(yīng)增加，從而保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性，提高了肥肝品質(zhì)。

本試驗(yàn)研究表明，填飼日糧中添加維生素E能顯著提高肝臟中L-FABP mRNA的相對(duì)表達(dá)量，且當(dāng)維生素E添加量為40 mg/kg時(shí),騾鴨肝臟組織中L-FABP mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高。維生素E對(duì)肝臟中LFABP mRNA表達(dá)量的影響能有以下兩個(gè)原因。一方面，維生素E在肥肝形成中發(fā)揮抗氧化作用，使β-氧化途徑降解的脂肪酸少于生成的脂肪酸，導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞中大量堆積，進(jìn)而增加L-FABP mRNA的表達(dá)量。張小純等[8]研究發(fā)現(xiàn)維生素E能增加騾鴨肝臟中脂肪含量，改變脂肪酸組成。另一方面，維生素E具有調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)的作用，維生素E可以誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）靶基因的表達(dá)（CAmpbell等，2002；De Pascale 等，2006）[9-10]。PPAR 在脂肪酸分解代謝率高的組織中高表達(dá)，如肝臟、腎臟等，通過誘導(dǎo)線粒體和過氧化物酶體氧化水平及L-FABP基因表達(dá)來刺激脂肪酸分解代謝，L-FABP是PPAR重要的靶基因。因此，維生素E可能直接對(duì)L-FABP基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，高能量填飼日糧可以顯著的提高騾鴨肝臟L-FABP mRNA表達(dá)量，說明L-FABP基因參與了肥肝品質(zhì)的調(diào)控。填飼日糧中添加維生素E可以顯著提高騾鴨肝臟組織中L-FABP mRNA的表達(dá)量，維生素E可能通過影響肝臟L-FABP mRNA的表達(dá)量，維持肝臟脂肪酸代謝的平衡，保證騾鴨肥肝的品質(zhì)。

[1]張虎,朱金玲,張玉萍,等.肝型脂肪酸結(jié)合蛋白與脂類轉(zhuǎn)運(yùn)[J].世界華人消化雜志,2008,16(27):3065-3069.

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[5]周敏.維生素E對(duì)櫻桃谷鴨產(chǎn)肝性能及血液理化指標(biāo)的影響[D].廣西:廣西大學(xué),2005.

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