單達(dá)聰 王四新 季海峰 劉 輝

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

經(jīng)過(guò)微生物固態(tài)發(fā)酵的豆粕其物質(zhì)成分發(fā)生了很大的變化，檢測(cè)指標(biāo)很多，概括起來(lái)包括感官指標(biāo)、技術(shù)指標(biāo)、安全指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)。單純從技術(shù)指標(biāo)就有很多，全面檢測(cè)非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也難以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中。因此確定關(guān)鍵性的少數(shù)技術(shù)指標(biāo)用于發(fā)酵豆粕品質(zhì)的快速評(píng)價(jià)是非常重要的研究?jī)?nèi)容。固態(tài)發(fā)酵豆粕的主要目的是鈍化或消除其抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中最主要的是通過(guò)發(fā)酵處理降解蛋白質(zhì)類抗?fàn)I養(yǎng)因子，如7S和11S蛋白、胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素，使之失去抗?fàn)I養(yǎng)作用。同時(shí)，在降解大分子蛋白質(zhì)的過(guò)程中還可以積累大量的肽和游離氨基酸，從而提高豆粕蛋白質(zhì)的消化吸收率和動(dòng)物健康水平。但在發(fā)酵過(guò)程中部分氨基酸會(huì)被脫羧酶和氨基轉(zhuǎn)移酶分解，積累一定量的胺類等含氮物，而降低豆粕的飼用價(jià)值。在發(fā)酵豆粕應(yīng)用于仔豬日糧實(shí)踐中，曾出現(xiàn)仔豬腹瀉增多、生長(zhǎng)性能下降等負(fù)面情況也證明了這一點(diǎn)。固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)工藝中，不同生產(chǎn)批次間品質(zhì)不穩(wěn)定性影響飼養(yǎng)效果，且表現(xiàn)突出，因此發(fā)酵豆粕品質(zhì)的批次檢驗(yàn)評(píng)價(jià)尤為重要。目前鮮見(jiàn)發(fā)酵豆粕品質(zhì)評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)的研究報(bào)道。以發(fā)酵豆粕含氮物檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性及其與飼養(yǎng)效果的關(guān)系兩個(gè)角度，開(kāi)展兩個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)研究，為確定發(fā)酵豆粕簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的技術(shù)評(píng)價(jià)指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)。

試驗(yàn)一：發(fā)酵豆粕檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性研究。

1 材料和方法

1.1 菌種和豆粕

米曲霉（Aspergillus oryzae），孢子干粉制劑，孢子含量≥5×109個(gè)/g。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），干粉制劑，活菌數(shù)≥2×1010cfu/g。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，干粉制劑，活菌數(shù)≥2×1010cfu/g。

豆粕，普通豆油生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的帶皮豆粕，粗蛋白含量44%。

1.2 設(shè)施、設(shè)備與儀器

發(fā)酵溫室；不銹鋼發(fā)酵曲盤(pán)、可密封塑料袋；全自動(dòng)定氮儀、酸度計(jì)、高效液相色譜儀、分析天平。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作方法

以最常用的發(fā)酵菌種和發(fā)酵方式組合，獲得不同蛋白質(zhì)水解度的樣品，研究豆粕蛋白質(zhì)降解各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性。具體發(fā)酵處理方法見(jiàn)表1。

表1 固態(tài)發(fā)酵豆粕處理工藝參數(shù)

采用固態(tài)淺盤(pán)發(fā)酵工藝，好氧與厭氧結(jié)合連續(xù)進(jìn)行。8個(gè)處理，3次重復(fù)共24個(gè)樣品，每樣品風(fēng)干基礎(chǔ)豆粕2000 g，干粉菌種接種量0.3%，加水量料水比1：0.8。接種、加水、混合均勻后裝入不銹鋼淺盤(pán)加透氣蓋，置30℃溫室好氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)，混合均勻后轉(zhuǎn)入塑料袋排氣密封，置于38℃溫室，厭氧發(fā)酵與酶解?？倳r(shí)間達(dá)到18 h后結(jié)束發(fā)酵，檢測(cè)樣品。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

總氮（TN，%）和粗蛋白（CP,%）含量采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定GB/T 5009.5—2010》第一法中的自動(dòng)凱氏定氮儀法；

揮發(fā)性鹽基總氮（TVBN，mg/100 g），半微量凱氏定氮法；

游離氨基酸（FAA，%）和總氨基酸（TAA，%）含量測(cè)定采用高效液相色譜法（HPLC法）；

酸溶蛋白（TCA－SP,%）和肽含量(%)，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《大豆肽粉GB/T 22492—2008》方法。

1.5 相關(guān)系數(shù)計(jì)算方法

相關(guān)系數(shù)計(jì)算采用Mcrosoft Excel XP的數(shù)據(jù)分析功能進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

發(fā)酵豆粕品質(zhì)的穩(wěn)定性是保證飼養(yǎng)效果的重要內(nèi)容，實(shí)際生產(chǎn)中出現(xiàn)的問(wèn)題，由于不同工藝參數(shù)和不同批次造成產(chǎn)品飼養(yǎng)效果差異很大的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮。從表2可見(jiàn)，試驗(yàn)設(shè)置的發(fā)酵工藝參數(shù)的不同對(duì)豆粕蛋白質(zhì)降解技術(shù)指標(biāo)形成了系列梯度，其中揮發(fā)性鹽基氮、游離氨基酸和蛋白質(zhì)水解度指標(biāo)系列的變異系數(shù)很大，分別為116.2%、97.6%和35.2%；但酸溶蛋白質(zhì)和肽含量的變異系數(shù)較小，分別為20.1%和13.1%，而粗蛋白質(zhì)含量和總氨基酸含量的變異系數(shù)很小，分別為1.5%和4.5%。從不同的發(fā)酵工藝參數(shù)和批次影響發(fā)酵豆粕品質(zhì)穩(wěn)定性的角度看，變異系數(shù)較大的指標(biāo)更適合用于其品質(zhì)的評(píng)價(jià)，顯然TVBN、FAA、DH更適合，而CP和TAA則不是重點(diǎn)。從營(yíng)養(yǎng)和免疫技術(shù)的角度看，肽含量是很重要的指標(biāo)，但其變異系數(shù)較小而相對(duì)穩(wěn)定，也就是說(shuō)其檢測(cè)的重要性處于中等水平。

各指標(biāo)間的變化趨勢(shì)是否相同或相關(guān)是簡(jiǎn)化檢測(cè)指標(biāo)的重要方法。各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表2 發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

表3 發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度及其產(chǎn)物含量相關(guān)系數(shù)

分析表3可見(jiàn)，發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度與鹽基氮含量、酸溶蛋白含量、游離氨基酸含量均呈現(xiàn)高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9611、0.8184、0.9533，均為極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；但與粗蛋白質(zhì)含量、肽含量和總氨基酸含量則呈現(xiàn)較低的正相關(guān)，均沒(méi)有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）?？梢?jiàn)，隨蛋白質(zhì)水解度提高，豆粕中蛋白質(zhì)類抗?fàn)I養(yǎng)的大分子物質(zhì)被水解為小分子時(shí)，累積的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，如酸溶蛋白質(zhì)、游離氨基酸和鹽基氮隨之顯著增加；但粗蛋白質(zhì)、總氨基酸和肽含量不一定隨之增加或穩(wěn)定在某一基本水平，其中粗蛋白質(zhì)含量穩(wěn)定在50%左右，總氨基酸含量穩(wěn)定在46%左右，肽含量變化稍大（4.17%～6.03%）。

試驗(yàn)二：蛋白質(zhì)水解度和揮發(fā)性鹽基總氮對(duì)仔豬飼養(yǎng)效果的影響

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將5種不同蛋白質(zhì)水解度和鹽基氮含量的豆粕作為試驗(yàn)材料。①普通豆粕，惠福糧油集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，DH=2.24%，TVBN=10.4 mg/100 g；②發(fā)酵豆粕A，DH=4.70%，TVBN=186.0 mg/100 g；③發(fā)酵豆粕 B，DH=22.20%，TVBN=519.0 mg/100 g；④混合豆粕 A，即發(fā)酵豆粕A與普通豆粕1：1比例的均勻混合物，DH=3.47%，TVBN=98.2 mg/100 g；⑤混合豆粕 B，即發(fā)酵豆粕B與普通豆粕1：1比例的均勻混合物，DH=12.22%，TVBN=264.7 mg/100 g。DH和TVBN的檢測(cè)方法同試驗(yàn)一。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組管理

試驗(yàn)動(dòng)物為長(zhǎng)大雜交一代35日齡斷奶健康仔豬60頭，體重相近，公母各半。隨機(jī)分為5組，分別作為對(duì)照組和試驗(yàn)1、2、3、4組；每組 12頭，分3圈飼養(yǎng)，每圈4頭為一個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期35 d。網(wǎng)床圈欄，自由采食，自由飲水，舍溫20～22℃。專人飼養(yǎng)，每天清掃衛(wèi)生，記錄喂量，觀察腹瀉。試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束稱重，每周結(jié)料。

1.3 試驗(yàn)日糧組成

對(duì)照組仔豬日糧配方為：玉米60%、普通豆粕19%、麥麩6.0%、魚(yú)粉5.0%、乳清粉4.0%、豆油2.0%、預(yù)混料4.0%。以試驗(yàn)材料②、③、④、⑤分別替代基礎(chǔ)日糧配方中的普通豆粕，依次配制試驗(yàn)1、2、3、4組的仔豬日糧，并制成顆粒飼料。粗蛋白含量：對(duì)照組和試驗(yàn) 1、2、3、4 組分別為 17.5%、17.6%、17.8%、17.5%、17.5%。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

日增重(g/d)：測(cè)定試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)仔豬體重,增重總量與試驗(yàn)天數(shù)的比值即日增重；采食量(g/d)；飼料增重比(F/G)：耗料與增重的比值；腹瀉率(DR，%)：每天清晨觀測(cè)記錄仔豬腹瀉現(xiàn)象，1頭1次記為腹瀉1頭日,仔豬腹瀉頭日數(shù)與試驗(yàn)豬總飼養(yǎng)日數(shù)的比值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行方差分析和鄧肯法多重比較。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表示方法：均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；肩標(biāo)字母表明均值差異比較結(jié)果，小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）,大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

生產(chǎn)性能指標(biāo)與腹瀉率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)仔豬日增重、采食量、料重比及腹瀉率

2.1 日增重

表4中試驗(yàn)組與對(duì)照組日增重比較，試驗(yàn)1～4組依次為 542、420、377、410 g/d，均高于對(duì)照組（343 g/d），分別提高58.0%、22.4%、9.9%、19.5%，其中試驗(yàn)1組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），可見(jiàn)發(fā)酵豆粕替代普通豆粕可提高仔豬日增重；試驗(yàn)組之間比較，試驗(yàn)1組高于試驗(yàn) 2組（542 對(duì) 420 g/d，P＜0.05），表明發(fā)酵豆粕A優(yōu)于發(fā)酵豆粕B；試驗(yàn)3組均值低于試驗(yàn)4組(377對(duì) 410 g/d，P＞0.05)，表明當(dāng)發(fā)酵豆粕和普通豆粕按1：1的比例混合使用時(shí)，發(fā)酵豆粕A和發(fā)酵豆粕B沒(méi)有顯著差異；試驗(yàn)1組極顯著高于試驗(yàn)3組（542對(duì)377 g/d，P＜0.01），試驗(yàn)2組和試驗(yàn) 4組沒(méi)有顯著差異（420對(duì)410 g/d，P＞0.05）。綜合上述結(jié)果可見(jiàn)：發(fā)酵豆粕優(yōu)于未發(fā)酵豆粕；發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致鹽基氮過(guò)高，發(fā)酵豆粕與未發(fā)酵豆粕按1：1混合應(yīng)用，兩種情況均會(huì)降低發(fā)酵豆粕的飼養(yǎng)效果。

分析表5及圖1，隨豆粕蛋白質(zhì)水解度提高仔豬日增重先提高后下降，呈現(xiàn)二次函數(shù)趨勢(shì)，以DH=4.7%時(shí)日增重最高；從表5和圖2可見(jiàn)，隨著豆粕的鹽基總氮含量的提高，日增重的變化同樣呈現(xiàn)二次函數(shù)趨勢(shì)，且與蛋白質(zhì)水解度和日增重的關(guān)系方向相同，結(jié)合兩指標(biāo)的性質(zhì)有理由認(rèn)為：隨著豆粕蛋白質(zhì)水解度的提高，鹽基總氮隨之上升，仔豬的耐受性在鹽基總氮達(dá)到186 mg/100 g時(shí)達(dá)極限，超過(guò)該值時(shí)日增重開(kāi)始下降。

表5 仔豬日糧豆粕蛋白質(zhì)水解度、揮發(fā)性鹽基氮與日增重、料重比比較

圖1 蛋白質(zhì)水解度與日增重的關(guān)系

圖2 鹽基總氮與日增重的關(guān)系

2.2 采食量和料重比

比較表4中各組試驗(yàn)仔豬采食量，試驗(yàn)組1、2組比對(duì)照組分別提高32.2%、12.0%，表明發(fā)酵豆粕可提高采食量，但發(fā)酵豆粕A優(yōu)于發(fā)酵豆粕B；試驗(yàn)3、4組與對(duì)照組基本持平（－4.0%、3.6%），將發(fā)酵豆粕與普通豆粕按1：1比例混合使用則效果降低。分析表4中的料重比，試驗(yàn) 1、2、3、4組均優(yōu)于對(duì)照組，分別為（F/G）1.51、1.65、1.57、1.56 對(duì) 1.80，比對(duì)照組分別降低16.1%、8.3%、12.8%、13.3%，表明發(fā)酵豆粕可提高飼料利用率；試驗(yàn)1組、2組之間比較，發(fā)酵豆粕A優(yōu)于發(fā)酵豆粕B（1.51對(duì) 1.65）。

2.3 腹瀉率

從表4中可見(jiàn)，試驗(yàn)1、2、3、4組和對(duì)照組的全程腹瀉率分別為(DR)5.3%、13.9%、12.5%、21.1%、24.3%，與對(duì)照組相比分別降低77.9%、42.7%、48.5%、13.3%，各試驗(yàn)組仔豬腹瀉率均明顯低于對(duì)照組，表明發(fā)酵豆粕可明顯降低仔豬腹瀉率。發(fā)酵豆粕A優(yōu)于發(fā)酵豆粕B,表明發(fā)酵豆粕過(guò)高揮發(fā)性鹽基總氮含量(186對(duì)519 mg/100 g)可導(dǎo)致腹瀉率增加；試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組比較（5.3%對(duì)12.5%），試驗(yàn)2組和試驗(yàn)4組比較 (13.9%對(duì)21.1%),分別降低腹瀉率57.6%和34.1%，表明發(fā)酵豆粕和普通豆粕按1：1混合使用同樣可以降低仔豬腹瀉率，但效果下降。

3 小結(jié)與討論

蛋白質(zhì)的功能活性與其分子結(jié)構(gòu)和分子量存在直接關(guān)系，豆粕中蛋白質(zhì)類抗?fàn)I養(yǎng)因子的抗?fàn)I養(yǎng)作用因?yàn)榘l(fā)酵水解而形成酸溶蛋白和游離氨基酸等產(chǎn)物，使其降低或消除。豆粕蛋白質(zhì)水解度反映出蛋白質(zhì)大分子水解為小分子或游離氨基酸的程度,該指標(biāo)與發(fā)酵豆粕酸溶蛋白質(zhì)含量具有極顯著的正相關(guān)(r=0.8184,P＜0.01)，而肽含量與酸溶蛋白質(zhì)含量存在顯著的正相關(guān)（r=0.7184，P＜0.05），所以使用酸溶蛋白質(zhì)含量指標(biāo)評(píng)價(jià)發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)品質(zhì)時(shí)，既可以反映豆粕中抗原蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子被水解的程度，進(jìn)而揭示了該類抗?fàn)I養(yǎng)因子活性被消除的程度，同時(shí)又可一定程度上反映肽含量的高低，所以酸溶蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的較好且重要的指標(biāo)。從另一個(gè)角度看，隨著蛋白質(zhì)水解度的提高，水解產(chǎn)生的游離氨基酸單體被脫羧酶催化脫羧產(chǎn)生胺類化合物，鹽基氮含量隨之提高，因此過(guò)高的蛋白質(zhì)水解度可能導(dǎo)致豆粕中原有氨基酸被破壞而降低飼養(yǎng)效果，同時(shí)過(guò)高的揮發(fā)性鹽基氮還可能造成負(fù)面影響。

從對(duì)實(shí)際飼養(yǎng)效果的影響看，蛋白質(zhì)水解度和鹽基總氮含量交互影響仔豬的日增重等生產(chǎn)性能指標(biāo)。蛋白質(zhì)水解度過(guò)低和過(guò)高都會(huì)降低飼養(yǎng)效果，該指標(biāo)適宜值的范圍在3.47%～12.2%；試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕鹽基氮含量也直接影響到飼養(yǎng)效果，過(guò)高的鹽基氮會(huì)降低仔豬的生產(chǎn)性能指標(biāo)，該指標(biāo)值的適宜范圍應(yīng)低于186 mg/100 g。受本飼養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)置梯度的影響，具體蛋白質(zhì)水解度（或酸溶蛋白質(zhì)含量）和鹽基氮含量的優(yōu)化數(shù)據(jù)值應(yīng)進(jìn)一步研究。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，酸溶蛋白質(zhì)（或蛋白質(zhì)水解度）和揮發(fā)性鹽基總氮含量可以作為從正反兩個(gè)方向評(píng)價(jià)發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)品質(zhì)及其對(duì)飼養(yǎng)效果的影響，因此可以選擇這兩個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)品質(zhì)的主要指標(biāo)。

若干篇，刊略，需者可函索）