張大維 邴國強(qiáng) 甘振威 徐彩云 李萍 郭超

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料的標(biāo)準(zhǔn)化和無菌化是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔化、無菌化的基礎(chǔ)和必要條件。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要達(dá)到清潔級以上標(biāo)準(zhǔn)，飼料不僅要符合國家GB14924.2—2001[1]的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，而且要達(dá)到無菌的要求。滅菌是指殺滅或除去環(huán)境中一切微生物的過程[2]。選擇有效的滅菌方法，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料達(dá)到無菌標(biāo)準(zhǔn)的保證。顆粒飼料的滅菌方法要求其具有滅菌效果可靠、穿透力好、方法簡單、可普遍使用、成本較低、對飼料中營養(yǎng)成分損失小、無毒副作用的特點(diǎn)[3－5]，達(dá)到這一要求的滅菌方法，目前只有高壓蒸汽滅菌和60 Co－γ射線照射滅菌[2]2種方法。本實(shí)驗(yàn)是探討如何正確使用這兩種滅菌方式對鼠顆粒飼料進(jìn)行滅菌，在保證營養(yǎng)成分損失最少的情況下，達(dá)到無菌化的標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料和方法

1.1 材料

直徑12 mm鼠顆粒飼料，來源于長春市綠園區(qū)益生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料廠。

1.2 儀器與試劑

高壓蒸汽滅菌器（長春華日）、60 Co－γ射線源(長春應(yīng)化所)、智能干燥箱（杭州DHG900）、超微粉碎機(jī)（浙江 CWJ）、恒溫培養(yǎng)箱（上海 XMT－A7000）、潔凈工作臺(tái)（武漢 CJ1300S）、消化器（北京 ADE－V）、電子秤（T1000）、熒光分光光度計(jì)（上海970CRT型）、定氮儀（上海KDN－04A）、原子吸收分光光度計(jì)（上海AA320N）、脂肪測定儀（上海 SZF－06A）、粗纖維測定儀（上海 CXC－06）、馬弗爐（沈陽SM－2.8－10）。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (按GB/T4789.28—2003規(guī)定制作)、磷酸鹽緩沖液(按 GB/T4789.28—2003[1]中 3.22 規(guī)定)、0.9%滅菌生理鹽水、75%乙醇。

1.3 方法

1.3.1 滅菌效果實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1.1 鼠顆粒飼料樣品的分組

將直徑12 mm鼠顆粒飼料樣品分為11組，每組50 g。采用高壓蒸汽滅菌方法滅菌的飼料，按滅菌時(shí)間（15、20、25、30、35 min）分為 5 組，即實(shí)驗(yàn) 1～5 組；采用60 Co－γ射線照射方法滅菌的飼料，按照射劑量（10、15、20、25、30 kGy）分為 5 個(gè)組，即實(shí)驗(yàn) 6～10 組，分別按不同時(shí)間和劑量進(jìn)行高壓蒸汽滅菌和60 Co－γ射線照射滅菌；設(shè)對照組1組，采購的真空包裝60 Co－γ射線照射滅菌飼料，即第11組。

1.3.1.2 鼠顆粒飼料樣品的處理

將實(shí)驗(yàn)1～5組鼠顆粒飼料分別按不同滅菌時(shí)間（15、20、25、30、35 min）進(jìn)行 121 ℃、0.14 MPa 高壓蒸汽滅菌。其方法為將飼料放入高壓蒸汽滅菌器，操作按標(biāo)準(zhǔn)反復(fù)真空3次，減壓至0.08 MPa以后開始滅菌[3]。將實(shí)驗(yàn)6～10組的鼠顆粒飼料放入60 Co－γ射線條件下，通過點(diǎn)式照射選擇不同的射線劑量（10、15、20、25、30 kGy）。照射時(shí)為同一位置，照射時(shí)間為 24～36 h[3]。

1.3.1.3 微生物學(xué)檢驗(yàn)——菌落總數(shù)測定

實(shí)驗(yàn)組（1～10組）滅菌后的顆粒飼料在超凈工作臺(tái)內(nèi)，按無菌操作方法進(jìn)行超微粉碎，取粉末25 g放入滅菌錐形瓶內(nèi)，加入滅菌玻璃珠和0.9%生理鹽水225 ml，充分振蕩制作成1：10的均勻稀釋液。

對照組超微粉碎后，取粉末25 g放入滅菌錐形瓶內(nèi)，加入滅菌玻璃珠和0.9%生理鹽水225 ml，充分振蕩制作成1：10的均勻稀釋液。用1 ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1 ml，沿管壁徐徐注入含有9 ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液）振搖試管，混合均勻，做成1：100的稀釋液。

吸取該稀釋度稀釋液1 ml，移于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制作2個(gè)培養(yǎng)皿。稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46℃營養(yǎng)培養(yǎng)基[可放置于(46±1)℃水浴保溫]注入培養(yǎng)皿約15 ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使混合均勻。同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1 ml稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置(36±1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)(48±2)h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2 不同滅菌方法對營養(yǎng)成分的影響實(shí)驗(yàn)方法

按檢測項(xiàng)目取7份樣品(重量100 g/份)。將取得的樣品中留一組不經(jīng)任何方式滅菌處理作為對照組；按高溫高壓滅菌時(shí)間(20、25、30 min)分為 1～3 組，60 Co－γ 射線照射劑量 20、25、30 kGy分為 4～6 組。將 1～3組的樣品分別放入高壓滅菌器中，經(jīng)過高壓滅菌器121℃、0.14 MPa滅菌處理，高壓滅菌器均按標(biāo)準(zhǔn)操作，反復(fù)真空3次，減壓至0.08 MPa以下，開始計(jì)時(shí)滅菌[2]。1～3 組滅菌時(shí)間分別為 20、25、30 min。4～6組的樣品進(jìn)行60 Co－γ射線照射滅菌，分別按射線劑量20、25、30 kGy 進(jìn)行滅菌，照射時(shí)間為 24～36 h[2]。所有經(jīng)滅菌處理后鼠顆粒飼料樣品,利用超微粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎備用。

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T14924.9、10、11、12—2001）《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料成分的測定》規(guī)定，測定飼料樣品中常規(guī)指標(biāo)（水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、鈣、磷）、氨基酸成分（賴氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）、維生素（A、D、E、K、B1、B2、B6、煙酸、泛酸、葉酸、生物素、B12）及礦物質(zhì)微量元素（鎂、鉀、鈉、鐵、錳、銅、鋅、硒）的含量[1]。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 采用不同的滅菌方法對滅菌效果的影響(見表1)

在少于15 min高壓蒸汽滅菌和小于15 kGy照射滅菌時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)為陽性，隨著高壓蒸汽滅菌時(shí)間的延長和60 Co－γ照射劑量的增加，對飼料進(jìn)行滅菌的效果也就越好。而達(dá)到20 min高壓蒸汽滅菌時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)可表現(xiàn)為陰性；20 kGy 60 Co－γ射線照射滅菌菌落數(shù)即可為零。

表1 不同滅菌處理方法的滅菌效果

2.2 常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)在不同滅菌條件下的變化情況(見表2)

高壓蒸汽滅菌組與對照組比較，水分、粗蛋白、粗脂肪損失率有顯著性差異（P＜0.05），粗纖維、粗灰分、鈣和磷的損失率差異不顯著（P＞0.05）；且25 min、30 min與20 min組比較，水分、粗蛋白、粗脂肪含量差異顯著（P＜0.05），其它組分變化不明顯（P＞0.05）。各照射組與對照組比較差異不顯著（P＞0.05），各劑量組間比較也無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各常規(guī)營養(yǎng)成分含量(%)

2.3 高壓蒸汽滅菌和60 Co－γ射線照射滅菌對氨基酸、礦物質(zhì)及維生素的影響(見表3～表5)

由表3可知，與對照組相比較，蒸汽滅菌組賴氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、精氨酸組氨基酸損失明顯（P＜0.05），且 25 min、30 min 與 20 min組比較，其損失隨時(shí)間增加而增加（P＜0.05），其他種類氨基酸損失差異不顯著（P＞0.05）；由表4可知，微量元素鐵與對照組相比有顯著差異（P＜0.05），其他微量元素與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），不同滅菌時(shí)間組元素的變化并無顯著差異（P＞0.05）。由表5可知，維生素中維生素 A、D、E、K、B1、B2、B6、B12、煙酸、泛酸的損失率隨著滅菌時(shí)間的延長，損失率隨之加大，不同的滅菌時(shí)間維生素的損失率有顯著性差異(P＜0.05)。

照射滅菌則對氨基酸、礦物質(zhì)及維生素的影響很小(P＞0.05)；且各劑量組間也無差異性(P＞0.05)。

表3 不同滅菌條件對鼠顆粒飼料中氨基酸含量及損失率的影響

表4 礦物質(zhì)營養(yǎng)成分損失率測定結(jié)果

表5 不同滅菌條件對維生素含量的影響

3 討論

采用高溫、高壓蒸汽和60 Co-γ射線照射方法對飼料進(jìn)行滅菌，己有很多研究報(bào)道[6－7]，但結(jié)果存在很大差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，選擇最佳條件就能實(shí)現(xiàn)對鼠顆粒飼料有效滅菌，從而減少能源浪費(fèi)，降低飼料成本。

高溫、高壓蒸汽滅菌使水分、粗蛋白、粗脂肪含量產(chǎn)生一定的改變。由于飼料中的蛋白質(zhì)在濕、熱和壓力作用下，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，打破了原來的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性；粗纖維、粗灰分、鈣和磷成分的損失率差異不顯著，說明溫度、壓力對其飼料影響不大；對微量元素鐵造成一定的損失，原因在于在消毒過程中受到高濕、熱和壓力等作用，使一水硫酸亞鐵（FeSO4·H2O）發(fā)生氧化、潮解等一系列化學(xué)變化，生成高價(jià)鐵的氧化物，從而失去鐵的功效；氨基酸有不同程度的減少，與蛋白質(zhì)的高溫變性有關(guān)，美拉德反應(yīng)和氧化作用對濕熱較敏感的氨基酸產(chǎn)生影響；維生素是生物活性的化學(xué)物質(zhì)，有不飽和碳原子、雙鍵、羥基等不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定。尤其水溶性維生素在高溫、高濕環(huán)境下極易破壞，降低活性，失去應(yīng)有的作用。因此，在飼料的消毒滅菌過程中，應(yīng)考慮到根據(jù)營養(yǎng)成分破壞程度采取相應(yīng)添補(bǔ)問題，使飼料成為有營養(yǎng)的全價(jià)顆粒料。

采用60 Co-γ射線照射滅菌時(shí)，常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)、氨基酸、維生素、微量元素的損失率差異不顯著（P>0.05）；且各劑量組間也無差異性（P>0.05）。60 Co-γ 射線照射滅菌方式對飼料中營養(yǎng)成分破壞較小。綜上所述，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠顆粒飼料滅菌的適宜條件為121℃、0.14 MPa、20 min高壓蒸汽滅菌或20 kGy 60 Co-γ射線照射滅菌。

[1]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T14924.11—2001）《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料維生素的測定》[S].

[2]薛廣波.實(shí)用消毒學(xué)[M].(第1版).北京：人民軍醫(yī)出版社,1986：9-15.

[3]魏泓.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].(第1版).成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社,1998：2-23.

[4]崔立.動(dòng)物性食品中重要致病微生物的隱性危害[J].飼料工業(yè)，2006，27(11)：46-48.

[5]王四旺，施新猷，婁清林.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料60 Co-γ線輻射后營養(yǎng)成分分析[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué),1988,18(3)：147.

[6]梁永利，竇如海,石天虹，等.60 Co-γ射線輻射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料滅菌效果的觀察[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志,2000，10(4)：230-232.

[7]王兆彰，肖旭光，馬麗，等.裸小鼠飼料滅菌方法的探討[J].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，1987,7(4)：29.