魏 鳳，楊仁斌，蔣 波，傅 強(qiáng)，蔣詩琪，盧靜宜

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所，湖南 長沙 410128）

嘧肽霉素是由不吸水鏈霉菌（Streptomyces achygroscopicus）產(chǎn)生的一種新型的抗病毒農(nóng)用抗生素，對番茄病毒病、煙草花葉病毒病、辣椒病毒病、瓜類病毒病和玉米矮花葉病毒病等均有顯著防效[1-2]。目前，對嘧肽酶素的研究主要集中在生產(chǎn)、抗病機(jī)理及其抗生組份等方面，而對嘧肽酶素分析檢測方法的報道較少。筆者采用高效液相色譜法對嘧肽酶素進(jìn)行檢測分析，探討了嘧肽酶素的色譜檢測條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀（帶紫外檢測器及LC solution工作站，日本島津公司）；紫外分光光度計（島津UV-2450）；玻璃儀器氣流烘干器（KQ-C，鞏義市英峪予華儀器廠）；超聲波清洗器（KQ-100 E，昆山市超聲儀器有限公司）；萬分之一天平（島津AUY 220）；電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）。

1.1.2 主要試劑 99.0%的嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)品和4.0%的嘧肽酶素試樣（農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所）；甲醇（色譜純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)液和試樣的配制 標(biāo)液：準(zhǔn)確稱取0.025 0 g嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)品于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液（甲醇∶水=20∶80，V∶V）溶解并稀釋至刻度。試樣：準(zhǔn)確稱取0.025 0 g嘧肽酶素試樣于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，用0.45μm濾膜過濾，濾液備用。

1.2.2 色譜條件 Inertsil ODS-SP色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；進(jìn)樣量 20 μL。對檢測波長、流動相配比、流速及柱溫4個條件進(jìn)行優(yōu)化：在190～350 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選擇最適檢測波長；流動相為甲醇-水溶液，體積比：1∶99、4∶96、7 ∶93、10 ∶90； 流 速 ：1.0 mL/min、0.9 mL/min、0.8 mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min）；柱溫：25℃、30℃、35℃。

1.2.3 測 定 在最適色譜條件下，待儀器基線基本穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，計算各次響應(yīng)值的重復(fù)性，待相鄰2次的響應(yīng)值變化小于1%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定[3]。

試樣嘧肽酶素質(zhì)量分?jǐn)?shù) X1（%）=A2·m1·P/A1·m2；式中：A1為標(biāo)樣溶液中嘧肽酶素的峰面積平均值，A2為試樣溶液中嘧肽酶素的峰面積平均值，m1為標(biāo)樣的質(zhì)量（g），m2為試樣的質(zhì)量（g），P 為標(biāo)樣中嘧肽酶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）。

1.2.4 線性關(guān)系檢驗 準(zhǔn)確稱取嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇-水溶液逐級稀釋，配置成一系類質(zhì)量濃度為 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2mg/L 的工作液；在最適色譜條件下，分別進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度的檢驗 在最適色譜條件下，對同一待測樣品重復(fù)測定6次，以檢驗分析方法的穩(wěn)定性；準(zhǔn)確稱取5份含有嘧肽酶素的平行試樣，分別加入等量的嘧肽酶素標(biāo)樣，在最適色譜條件下，測定其添加回收率，以檢驗分析方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

將質(zhì)量濃度為1 mg/L的嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～350 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描（圖1），結(jié)果表明在250 nm及279 nm處的吸收值相對較大，但在279 nm處樣品中雜質(zhì)干擾較為強(qiáng)烈，故確定250 nm為檢測波長。

圖1 嘧肽酶素紫外波長掃描

2.2 流動相、柱溫和柱流量的選擇

在高效液相色譜操作條件下，用峰面積進(jìn)行定量，其保留時間和分離效果進(jìn)行定性[4]，結(jié)果表明：當(dāng)甲醇-水體積比為4∶96，柱溫為30℃，柱流量為0.7 mL/min時，對嘧肽酶素的分離效果最好，峰形最好，保留時間相對適宜（圖2）。這表明甲醇-水體積比4∶96，柱溫30℃，柱流量0.7 mL/min為最適色譜條件。

2.3 線性關(guān)系

圖2 最適色譜條件下嘧肽酶素的檢測峰

以工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、測得的相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到的線性方程為y=46 618 x+427.84，r=0.999 9，線性關(guān)系良好。

2.4 分析方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度

在最適色譜條件下，對同一待測樣品進(jìn)行6次重復(fù)測定，檢測結(jié)果分別為4.01%、3.99%、4.00%、4.01%、3.98%、4.00%，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.19，變異系數(shù)為0.20%。這表明該色譜條件下樣品的檢測較穩(wěn)定，精密度較高。準(zhǔn)確度試驗結(jié)果（表1）表明：嘧肽酶素的添加回收率均在97.40%以上，平均添加回收率達(dá)98.81%，這表明該分析方法準(zhǔn)確度較高。

表1 嘧肽酶素的添加回收率

3 結(jié)論

在標(biāo)樣和樣品溶液配置時，如果采用100%的甲醇進(jìn)行溶解，嘧肽酶素的溶解效果一般，且在嘧肽酶素檢測時檢測峰不對稱，響應(yīng)值明顯變小，故在配制標(biāo)樣和樣品時先用少量20%甲醇溶液對嘧肽酶素進(jìn)行超聲溶解，所得檢測峰峰形尖銳，對稱，響應(yīng)值高。

采用高效液相色譜法測定嘧肽酶素，操作簡便、快速，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，檢測結(jié)果穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高，這表明高效液相色譜法適用于嘧肽酶素的檢測分析。

[1] 王艷紅，吳元華，朱春玉，等.嘧肽霉素又一抗病毒活性成分的研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（1）：44-47.

[2] 穆凌霄，伏 穎，趙秀香，等.嘧肽霉素一種新的生物活性組分分離純化研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（18）：3728-3731.

[3] 柳王榮，楊仁斌，黃堯，等.甲維鹽在水稻環(huán)境中的殘留分析方法[J].農(nóng)藥，2011，50（5）：362-364.

[4] 鄭立國，楊仁斌.虱螨脲在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的檢測方法及持久性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，28（11）：2407-2411.