李全健 ，王彩霞 ，田 敏 ，李翠新

（1.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽(yáng) 311400）

扇脈杓蘭（Cypripedium japonicum Thunb.）屬蘭科（Orchidaceae）杓蘭屬（Cypripedium Linn.），生于海拔1 000～2 000 m的灌木林下、林緣、蔭蔽山坡等濕潤(rùn)和腐殖質(zhì)豐富的土壤上[1]。目前對(duì)于扇脈杓蘭的研究主要集中在傳粉生態(tài)學(xué)[2]方面，有關(guān)扇脈杓蘭分子生物學(xué)相關(guān)的研究尚未見報(bào)道。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的結(jié)合[3]，是一種理想的分子標(biāo)記技術(shù)。已經(jīng)在杜仲[4]、蘋果[5]、葡萄[6]等多種植物[7-8]上建立了AFLP體系，并對(duì)菊花[9]、紅花[10]等多種植物進(jìn)行了遺傳多樣性研究。盡管AFLP標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是其操作復(fù)雜，操作中的影響因素較多。建立扇脈杓蘭AFLP體系，對(duì)進(jìn)一步研究其種質(zhì)資源多樣性和分子標(biāo)記輔助育種有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為野生扇脈杓蘭嫩葉，取材后立即放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80℃冰箱中。

1.2 方法

SDS 法[11]、高鹽低 pH 法[12]、常規(guī) CTAB 法[11]、高鹽CTAB法（將常規(guī)CTAB法提取緩沖液中的Na－Cl的濃度由 1.4mol/L增至 2.0mol/L，其它和常規(guī)CTAB法相同）和改良CTAB法。

試驗(yàn)步驟：將材料研磨成粉末后，取約50 mg的凍粉于離心管中再加入CTAB（50mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、0.7 mol/L NaCl）200 μL 和10μLβ-巰基乙醇，充分混勻后加入800μL 65℃預(yù)熱的CTAB和10μL蛋白酶K，顛倒數(shù)次，65℃恒溫水浴 60 min，10 min/次搖勻；取出冷卻后加入800 μL 酚∶氯仿∶異戊醇（體積比為 25∶24∶1），顛倒混勻 2 min，靜置 5 min后12 000 r/min離心 15 min；取上清液，加等體積的氯仿∶異戊醇（體積比為24∶1）顛倒 2 min，靜置5min后12 000 r/min離心 15 min；取上清液，加1/10體積5mol/L的醋酸鈉和等體積的異丙醇，沉淀15 min。8 000 r/min離心10 min，去上清；70%乙醇洗滌兩次，風(fēng)干后溶于400 μL去離子水；加入10μL RNase，37℃消化 1 h，65℃水浴20min，稍冷卻加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻后 12 000 r/min 離心 15 min；取上清液，加入1/10體積5mol/L的醋酸鈉和兩倍體積-20℃無(wú)水乙醇，－20℃ 沉淀 20 min；8 000 r/min 離心10min；70% 乙醇洗滌兩次（10min/次），風(fēng)干后加40μL去離子水，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA純度及濃度檢測(cè)

取 5μL DNA 樣品，加 1 μL 6×Loading buffer，在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳；用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA在260 nm和280 nm處的吸光值。根據(jù)電泳譜帶和A260/A280值判斷DNA的純度，根據(jù)公式：DNA 濃度（μgmL-1）=A260×50 μg/mL×稀釋倍數(shù)，計(jì)算總DNA的濃度。

1.4 限制性內(nèi)切酶酶切分析

1.4.1 酶切體系 酶切反應(yīng)體系為20μL，各組份為：模板 DNA 1μg，10×NEB 緩沖液 2.0 μL，EcoRⅠ（10 U/L）0.5 μL，MseⅠ（10 U/L）0.5 μL，BSA 0.2 μL，加雙蒸水至20μL。為了獲得扇脈杓蘭DNA酶切的最佳反應(yīng)時(shí)間，酶切時(shí)間分別設(shè)為 1、2、3、4、5 h。酶切消化后，65℃ 滅活20min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。

1.4.2 連接體系 在20μL反應(yīng)體系中加入10 μL酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液2.0μL，MseⅠ接頭 1.0μL，EcoRⅠ接頭 1.0 μL，T4 DNA連接酶（400 U/L）1.0 μL，滅菌雙蒸水5 μL。16℃連接反應(yīng)90min，連接反應(yīng)結(jié)束后，65℃滅活20min。

1.4.3 擴(kuò)增體系 初始擴(kuò)增體系參照相關(guān)研究論文和常規(guī)的PCR反應(yīng)中各組分的量，確定扇脈杓蘭AFLP初始反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積50μL，內(nèi)含0.25 μL Ex Taq，5.0 μL 10×Ex Taq buffer，4.0 μL dNTPMixture，4μLMg2+，模板 DNA 2.5 ng，M00 和E00各2.0μL，加滅菌蒸餾水至 50μL。對(duì)AFLP反應(yīng)體系中的5種反應(yīng)成分分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)（見表1），確定合適反應(yīng)條件。

表1 PCR反應(yīng)體系中處理因素和水平

預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：95℃變性 30 s，56℃復(fù)性 30 s，72℃ 延伸 60 s；循環(huán)后 72℃延伸 10min；10℃保存。

選擇性擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃變性30 s，65℃復(fù)性 30 s，72℃延伸 70 s；65～56℃ （每個(gè)循環(huán)降0.7℃）退火30 s，72℃延伸70 s，共13個(gè)循環(huán)；94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 70 s，共 24個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，10℃ 保存。

1.4.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 取6μL（含上樣緩沖液）樣品，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h（80W 恒功率）。電泳結(jié)束后，銀染、拍照，從中選擇譜帶清晰和容易計(jì)數(shù)的引物作為AFLP反應(yīng)的最佳引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1所示為改良CTAB法提取基因組DNA 1%瓊脂糖凝膠電泳電泳圖，DNA電泳條帶清晰無(wú)拖尾，點(diǎn)樣孔無(wú)污染，DNA無(wú)降解，大小在23 000 bp左右。

圖1 改良CTAB法提取的基因組DNA瓊脂糖電泳圖

2.2 紫外檢測(cè)結(jié)果

由表2所示：5種提取方法在去除蛋白質(zhì)、多糖及酚類等污染物方面存在差異。改良CTAB法得到的DNA A260/A280在1.8～2.0之間，說(shuō)明污染物去除較為完全，DNA純度高。如果A260/A280<1.8，說(shuō)明DNA被蛋白質(zhì)或多糖污染。A260/A280>2.0，說(shuō)明RNA未去除干凈。

表2 不同方法提取總DNA結(jié)果的比較

2.3 限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果

AFLP分析中基因組 DNA常采用雙酶切，通常一個(gè)為稀有堿基切點(diǎn)酶，另一個(gè)為常見堿基切點(diǎn)酶。根據(jù)圖2可知，酶切產(chǎn)物電泳均勻，無(wú)主條帶，主要分布在100～1 000 bp之間，說(shuō)明酶切消化良好，可以用于分子標(biāo)記。

圖2 酶切效果

2.4 AFLP選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響由圖3可知，在設(shè)定的6個(gè)稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)均能擴(kuò)增出清晰譜帶，然而，濃度較大時(shí)（稀釋5～20倍），小片段的譜帶較清晰，當(dāng)濃度較小時(shí)（稀釋40～80倍），大片段的譜帶清晰可見，而小片段的譜帶變?nèi)?。因此選定產(chǎn)物稀釋20倍為模板DNA。

圖3 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)對(duì)選擇性擴(kuò)增的影響

2.4.2 dNTP用量對(duì)擴(kuò)增的影響 由圖 4可知dNTP使用量對(duì)擴(kuò)增的影響較大。當(dāng)dNTP的用量為3.0～4.0μL時(shí)擴(kuò)增條帶均清晰穩(wěn)定，擴(kuò)增的產(chǎn)物濃度較高；用量少于2.0μL時(shí)擴(kuò)增條帶較弱，而用量多于4.0μL（4.0～10μL）時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物變化不大，而且擴(kuò)增條帶減少且不清晰。說(shuō)明dNTP濃度太低或太高都會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物減少，影響擴(kuò)增效果。因此選擇3.0～4.0μL為dNTP的適宜用量。

圖4 dNTP濃度對(duì)選擇性擴(kuò)增的影響

2.4.3 Mg2+用量對(duì)擴(kuò)增的影響 圖5顯示不同Mg2+使用量條件下的PCR擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果顯示，2.0 μL的Mg2+用量太低，影響了DNA聚合酶的活性，基本上沒(méi)有產(chǎn)物或者產(chǎn)物的量較少；用量為3.0～10 μL下擴(kuò)增條帶均清晰穩(wěn)定，考慮到Mg2+用量過(guò)大時(shí)容易出現(xiàn)非特異性條帶，因此，選擇3.0～4.0μL作為Mg2+最優(yōu)使用量。

圖5 Mg2+濃度對(duì)選擇性擴(kuò)增的影響

圖6 引物用量對(duì)選擇性擴(kuò)增結(jié)果的影響

2.4.4 引物用量對(duì)擴(kuò)增的影響 引物使用量對(duì)擴(kuò)增的影響較為顯著。由圖6可見，引物用量為1.5～2.0μL時(shí)擴(kuò)增譜帶較為清晰，少于1.5μL時(shí)譜帶變?nèi)跎踔翢o(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，而用量大于2.0μL（4～6μL）時(shí)，譜帶出現(xiàn)特異性條帶，且位點(diǎn)發(fā)生變異，可能是引物濃度過(guò)高產(chǎn)生的錯(cuò)配現(xiàn)象。因此，選擇1.5～2.0 μL為引物的最佳使用量。

2.4.5 Taq DNA聚合酶用量對(duì)擴(kuò)增的影響 圖7表明，隨著Taq DNA聚合酶用量的增加，譜帶也越來(lái)越明亮，Taq聚合酶的用量少時(shí)（0.1μL），擴(kuò)增條帶亮度小，說(shuō)明產(chǎn)物濃度?。坏褂昧吭?.2～0.6 μL的范圍內(nèi)譜帶明亮，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度較高，之間亮度在增加但差異不明顯。在節(jié)省又不影響試驗(yàn)結(jié)果的前提下，選取用量0.2～0.3μL可達(dá)到試驗(yàn)要求。

圖7 Taq DNA聚合酶用量對(duì)選擇性擴(kuò)增的影響

2.5 AFLP反應(yīng)體系穩(wěn)定性的鑒定

圖8為24對(duì)引物對(duì)優(yōu)化體系的驗(yàn)證，引物編碼記為 E11/M1，E11/M2，E11/M12 和 E12/M1，E12/M2……E12/M12。體系各組分的最佳用量為預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍液4.0μL，dNTP 3.0μL，引物1.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL，Mg2+4.0 μL，每對(duì)引物一個(gè)重復(fù)，以鑒定扇脈杓蘭AFLP反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖8所示，24對(duì)引物在2個(gè)DNA中均能擴(kuò)增出清晰可辨的譜帶，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)表明，利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系能有效地對(duì)扇脈杓蘭7個(gè)不同群體DNA進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，而且具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可以推斷，優(yōu)化后的AFLP反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的。

圖8 不同引物選擇性擴(kuò)增電泳圖

3 討 論

植物組織中的多糖、酚、酯和萜等次生代謝物質(zhì)會(huì)對(duì)DNA的提取造成較大的困難，樣品不純，會(huì)影響后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)扇脈杓蘭葉片中多糖、蛋白質(zhì)、酚類化合物、等次生代謝產(chǎn)物的含量較高。在提取過(guò)程中加入β-巰基乙醇，能夠與多酚物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)可防止葉片中的多酚物質(zhì)氧化而使DNA呈褐色。高濃度醋酸鈉的引入及相應(yīng)的低溫冰凍，可以提高扇脈杓蘭基因組DNA的純度和得率，建議在提取扇脈杓蘭次生代謝物質(zhì)含量高的植物基因組DNA時(shí)采用。

AFLP反應(yīng)是先進(jìn)行酶切消化，再對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。酶切時(shí)間過(guò)短，則消化不完全，接頭難以連接；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅會(huì)延長(zhǎng)整個(gè)試驗(yàn)周期，而且容易出現(xiàn)星號(hào)活性。酶切與連接的時(shí)間應(yīng)控制適當(dāng)，以確保酶切消化完全和連接充分。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度對(duì)選擇性擴(kuò)增影響很大，模板濃度過(guò)高會(huì)引起非特異性擴(kuò)增；稀釋倍數(shù)過(guò)大，PCR產(chǎn)物過(guò)少，影響統(tǒng)計(jì)分析。并且體系各組分的多少都會(huì)對(duì)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)生影響。只有對(duì)各因素的用量篩選后，才能建立具有較高穩(wěn)定性的AFLP反應(yīng)體系。

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