曾 薇，楊瑩瑩，王向東，李 磊，李博曉，彭永臻

（北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京100124）

強化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR）作為一種經(jīng)濟可持續(xù)的除磷工藝在污水處理廠中得到了廣泛的應(yīng)用。EBPR工藝的實現(xiàn)主要依靠聚磷菌（Phosphate accumulation organisms，PAOs）在交替的厭氧／好氧環(huán)境中放磷及過量吸磷，然后通過排放剩余污泥達到除磷的目的。厭氧條件下，PAOs體內(nèi)的多聚磷酸鹽（polyphosphate，poly－P）分解，產(chǎn)生的能量用于揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）的 吸 收，并 以 聚 羥 基 烷 酸 （poly－βhydroxyalkanoates，PHA）的形式儲存于細(xì)胞內(nèi)。PHA合成所需的還原力由糖原的分解供給。好氧條件下，PAOs分解體內(nèi)儲存的PHA，獲得的能量用于細(xì)胞的生長、糖原的補充和磷的過量吸收及儲存［1］。

亞硝酸鹽作為硝化和反硝化過程的中間產(chǎn)物，廣泛存在于生活污水脫氮除磷系統(tǒng)中，并在一定條件下形成積累，含量甚至能夠達到19 mg／L以上［2－3］。有報道指出在污水生物處理系統(tǒng)中，高濃度的亞硝酸鹽對多種微生物產(chǎn)生抑制作用，包括普通需氧型異養(yǎng)菌和硝化細(xì)菌等［4－6］。近年，亞硝酸鹽對PAOs好氧吸磷和反硝化吸磷的抑制引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。Zhou等［7］以4種不同的污泥為研究對象，考察了亞硝酸鹽對PAOs反硝化吸磷過程的影響，發(fā)現(xiàn)亞硝的游離態(tài)形式——游離亞硝FNA（Free nitrous acid，F(xiàn)NA）才是真正的抑制劑，當(dāng)FNA濃度達到0．02 mg HNO2－N／L時，吸磷作用則被完全抑制。當(dāng)FNA從0．002 mg HNO2－N／L增加到0．02 mg HNO2－N／L時，聚磷菌的反硝化速率減小了約40%。Weon等［8］人以Acinetobacter sp為對象，研究了亞硝酸鹽對聚磷菌好氧代謝的影響，指出Acinetobacter sp的好氧生長和吸磷過程都受到了亞硝酸鹽的抑制。Pijuan等［9］進一步提出了FNA是真正的抑制劑，對好氧條件下Accumulibacter PAO的生長、糖原的合成以及吸磷都造成嚴(yán)重的抑制?？梢姡瑏喯跛猁}的存在對于EBPR系統(tǒng)的穩(wěn)定運行有著重要的影響。

目前，亞硝酸鹽對PAOs代謝影響的研究多集中于反硝化吸磷和好氧吸磷過程，而亞硝酸鹽對PAOs厭氧代謝影響的研究較少。本研究以來自不同的EBPR系統(tǒng)的活性污泥為研究對象，在厭氧條件下投加一定量的亞硝酸鹽，分析亞硝酸鹽對PAOs厭氧代謝的影響機制，有利于進一步了解亞硝酸鹽對生物除磷過程的影響。

1 材料與方法

1．1 實驗污泥和反應(yīng)器運行

試驗所用污泥取自2個不同的EBPR系統(tǒng)。

活性污泥1：取自實驗室SBR 1反應(yīng)器，該反應(yīng)器采用厭氧／好氧運行方式富集聚磷菌，進水為人工合成廢水。有效容積10 L，每天運行2周期，每周期290 min（厭氧120 min，好氧160 min，沉淀排水10 min），排水比1：4。通過調(diào)節(jié)流量計維持溶解氧在2．0±0．5 mg／L之間。用1M HCL和1M NaOH調(diào)節(jié)p H，維持厭氧進水初始p H＝7．5，好氧段p H在7．3～7．6之間。

活性污泥2：取自實驗室SBR 2反應(yīng)器，以厭氧／好氧方式運行，進水為實際生活污水。有效容積為7 L，每天運行3周期，每周期420 min（厭氧120 min，好氧240 min，沉淀排水60 min），排水比為1∶2。好氧階段溶解氧維持在2～3 mg／L之間，好氧末端亞硝酸鹽積累率達到95%以上。

1．2 試驗水質(zhì)

SBR1反應(yīng)器采用人工配水，每升配水所含成分見表1，其中營養(yǎng)液成分（1 L）：1．5 g FeCl3·6 H2O，0．15 g H3BO3，0．03 g CuSO4·5H2O，0．18 g KI，0．12 g MnCl2·4 H2O，0．06 g Na2MoO4·2 H2O，0．12 g ZnSO4·7 H2O，0．15 g CoCl2·6 H2O，10 g EDTA。配水的水質(zhì)為：COD濃度為800 mg／L，磷酸鹽濃度為20 mg／L。

表1 人工配水成份及水質(zhì)指標(biāo)

SBR2反應(yīng)器的實驗用水取自某生活小區(qū)化糞池的實際生活污水，試驗期間平均水質(zhì)主要參數(shù)為：COD＝175．7～223．8 mg／L，平均 194．5 mg／L；－N＝60．42～79．43 mg／L，平均69．44 mg／L；－P＝4．30～8．28 mg／L，平均5．71 mg／L。

1．3 靜態(tài)試驗

從2個SBR反應(yīng)器好氧末端取4 L污泥，清洗3遍，將清洗后的污泥平均分裝于4個反應(yīng)瓶中，然后加入人工配水至1．5 L。人工配水中不含磷源和碳源，其余成分如表1所示。向4個反應(yīng)瓶中分別加入10 m L 30 g／L的乙酸鈉溶液，使其初始碳源濃度達到200 mg／L。同時投加不等量的亞硝酸鈉，使得4個反應(yīng)瓶中亞硝態(tài)氮的濃度分別達到0、10、20和30 mg／L。實驗過程中在線監(jiān)測p H，用0．5 mol／L的HCL和0．5 mol／L NaOH調(diào)節(jié)并維持混合液的p H＝7．5±0．05，溫度控制為25℃±0．5℃。

1．4 分析方法

采用熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in－situ hybridization，F(xiàn)ISH）分析聚磷菌的富集程度。試驗中采用的16S r RNA寡核苷酸探針如表2所示。其中全菌探針EUBmix由EUB338、EUB338Ⅱ和EUB338Ⅲ混合而成；聚磷菌探針PAOmix由PAO462、PAO651和PAO846混合而成。

表2 FISH分析中采用的16S rRNA寡核苷酸探針［11－12］

2 實驗結(jié)果和分析

2．1 亞硝酸鹽對人工配水富集聚磷菌厭氧代謝的影響

圖1表示不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥1中VFA、PO3－4—P、PHA和NO－2—N濃度的變化。由圖1（a）可看出，與未投加亞硝酸鹽的情況相比，投加亞硝酸鹽的反應(yīng)瓶中VFA的消耗速率明顯減慢，直至反應(yīng)進行至120 min反應(yīng)瓶內(nèi)仍有VFA剩余。反應(yīng)進行至70 min時，未投加亞硝酸鹽的反應(yīng)瓶中VFA已經(jīng)消耗完，而亞硝態(tài)氮濃度分別為10、20和30 mg／L的反應(yīng)瓶中，VFA的濃度分別為73．88、92．93和98．25 mg／L。由圖1（c）可看出一部分VFA被聚磷菌吸收以PHA的形式儲存在體內(nèi)，而由圖1（d）可知還有一部分VFA被異養(yǎng)菌作為碳源用于亞硝酸型反硝化反應(yīng)。亞硝態(tài)氮濃度分別為10、20、30 mg／L時，亞硝酸鹽的利用速率基本一致，即反硝化速率沒有明顯的差異。由此可以看出，亞硝酸鹽對聚磷菌吸收VFA的過程造成抑制，但對于亞硝酸鹽的反硝化過程沒有明顯影響。

圖1 不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥1中VFA、—P、PHA和—N濃度的變化

圖1（b）反映了不同亞硝酸鹽濃度下磷酸鹽濃度的變化。與VFA的濃度變化不同，向反應(yīng)瓶中投加亞硝酸鹽不但沒有減少磷酸鹽的釋放量，反而促進了聚磷菌對磷酸鹽的進一步釋放，在反應(yīng)進行至70 min時，亞硝酸鹽濃度為30 mg／L的反應(yīng)瓶中磷酸鹽的釋放量達到67．8 mg／L，比未投加亞硝酸鹽反應(yīng)瓶中的濃度高6．9 mg／L。在未投加亞硝酸鹽的反應(yīng)瓶中，反應(yīng)進行至70 min時，磷酸鹽的釋放量 出 現(xiàn) 了 下 降 的 現(xiàn) 象，由 60．9 mg／L 降 至54．9 mg／L。觀察圖1（c）亞硝態(tài)氮濃度為0時聚磷菌合成PHA的變化情況，發(fā)現(xiàn)70 min時PHA濃度也出現(xiàn)了不增加反而下降的現(xiàn)象，PHA濃度由10．20 Cmmol／L降至9．64 Cmmol／L。以上現(xiàn)象說明反應(yīng)瓶中的VFA被消耗完之后，聚磷菌以體內(nèi)儲存的PHA為電子供體，以反應(yīng)瓶中少量溶解氧為電子受體進行吸磷反應(yīng)。

2．2 亞硝酸鹽對短程脫氮除磷活性污泥中聚磷菌厭氧代謝的影響

圖2表示不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥2中VFA、PO3－4—P、PHA和NO－2—N濃度的變化。從圖2（a）可以看出，當(dāng)亞硝態(tài)氮濃度分別為0、10、20、30 mg／L時，VFA 分別在120、90、50、50 min消耗完，投加亞硝酸鹽的反應(yīng)瓶中VFA的利用速率大于未投加亞硝酸鹽的反應(yīng)瓶中的VFA利用速率。從圖2（c）和圖2（d）可知，對于投加亞硝酸鹽的反應(yīng)瓶，VFA被聚磷菌吸收除了作為內(nèi)碳源被儲存于體內(nèi)之外，還有一部分VFA作為碳源用于亞硝酸型反硝化反應(yīng)，所以有亞硝酸鹽存在的反應(yīng)瓶中VFA的消耗速率較快。由圖2（d）亞硝態(tài)氮的變化曲線可知，當(dāng)亞硝態(tài)氮濃度為10、20、30 mg／L時，亞硝態(tài)氮的消耗速率沒有明顯的差異，說明亞硝酸鹽沒有抑制反硝化反應(yīng)。

圖2 不同亞硝酸鹽濃度下活性污泥2中VFA、—P、PHA和—N濃度的變化

圖2（b）表示了不同亞硝態(tài)氮濃度下聚磷菌釋放磷酸鹽的濃度變化，從曲線的變化可看出隨著亞硝態(tài)氮濃度的增大，聚磷菌釋放磷酸鹽的量減少。另外，可觀察到當(dāng)亞硝態(tài)氮為20和30 mg／L時反應(yīng)進行至50 min出現(xiàn)磷酸鹽濃度沒有升高反而降低的現(xiàn)象，而圖2（c）中相應(yīng)濃度下的PHA濃度也出現(xiàn)了一致的變化趨勢。由圖2（d）可看出50 min時，20 mg／L的反應(yīng)瓶中亞硝態(tài)氮全部被反硝化，此時30 mg／L的反應(yīng)瓶中仍存在5．5 mg／L亞硝態(tài)氮。以上現(xiàn)象說明，當(dāng)反應(yīng)瓶中碳源消耗完后，聚磷菌能夠以PHA為電子供體，以亞硝酸鹽為電子受體進行吸磷，這也說明該系統(tǒng)中存在反硝化聚磷菌。

由以上分析可知，30 mg／L的亞硝酸鹽對聚磷菌吸收VFA、釋放磷酸鹽、合成PHA和亞硝酸鹽的反硝化過程沒有形成明顯的抑制，但是亞硝酸鹽的存在仍對系統(tǒng)造成一定的影響。厭氧條件下投加亞硝酸鹽，系統(tǒng)中發(fā)生異養(yǎng)菌的反硝化作用，引起聚磷菌與普通異養(yǎng)反硝化菌之間對于VFA的競爭。而當(dāng)系統(tǒng)中的碳源不充足時，聚磷菌不能獲得足量的VFA，導(dǎo)致PHA的合成和磷酸鹽的釋放減少，進而影響好氧吸磷作用，若不補充碳源，最終將導(dǎo)致除磷系統(tǒng)的惡化。

2．3 微生物種群分析

圖3（a）和圖3（b）分別為活性污泥1和活性污泥2中全菌EUBmix和PAOmix合成圖。經(jīng)計算可知，活性污泥1中的聚磷菌占到全菌的55%，活性污泥2中的聚磷菌占到全菌的7．6%。由以上分析可知，對于處理實際生活污水的短程脫氮除磷活性污泥，由于生活污水的水質(zhì)復(fù)雜，進水有機物負(fù)荷變化較大，污泥中的微生物種群較豐富且抗沖擊負(fù)荷能力較強。當(dāng)系統(tǒng)中有亞硝酸鹽存在時，大量的異養(yǎng)菌能夠利用碳源快速的將亞硝酸鹽還原，從而在一定程度上減弱了亞硝酸鹽作為抑制劑對聚磷菌厭氧釋磷的抑制作用。而富集聚磷菌系統(tǒng)由于長期用人工配水培養(yǎng)聚磷菌，其污泥中微生物的組成較為簡單，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力較弱，當(dāng)系統(tǒng)中加入亞硝酸鹽后，聚磷菌的厭氧代謝受到了抑制作用。

圖3 2種活性污泥中聚磷菌的FISH合成效果圖

2．4 亞硝酸鹽抑制PAOs厭氧代謝的機理分析

2．4．1 亞硝酸鹽對PAOs吸收 VFA的影響Mino［13］在1987年提出乙酸通過主動運輸?shù)姆绞竭M入聚磷菌體內(nèi)，Smolders等［14］的實驗結(jié)果也支持了此觀點。Saunders等［15］在膜運輸水平下對厭氧條件下PAOs吸收VFA的機制進行了更深入的研究，發(fā)現(xiàn)乙酸通過細(xì)胞膜的驅(qū)動力主要來自質(zhì)子驅(qū)動力PMF，即次級運輸。質(zhì)子驅(qū)動力由Pit載體蛋白排出磷和質(zhì)子而產(chǎn)生［16］。

主動運輸?shù)倪^程需要消耗能量，關(guān)于微生物體內(nèi)ATP形成，目前最為公認(rèn)的是Peter D Mitchell在1961年提出化學(xué)滲透假說［17］，提出生成ATP的氧化與磷酸化之間起到偶聯(lián)作用的是H＋的跨膜梯度。現(xiàn)有研究認(rèn)為亞硝酸鹽是一種解偶聯(lián)劑，能夠提高質(zhì)子通過穿梭機制透過細(xì)胞膜的性能，破壞跨膜的質(zhì)子梯度［18］。在微生物體內(nèi)，由于細(xì)胞膜具有選擇性，H＋不能自由的通過細(xì)胞膜，于是在細(xì)胞膜的兩側(cè)形成了質(zhì)子跨膜梯度，而解偶聯(lián)劑能夠提高細(xì)胞膜對H＋的通透性，從而破壞了細(xì)胞膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，抑制ADP＋Pi生成ATP的磷酸化作用。由此而推測出，在富集聚磷菌的反應(yīng)瓶中投加的亞硝酸鹽是解偶聯(lián)劑，通過破壞質(zhì)子驅(qū)動力，破壞VFA主動運輸?shù)倪^程，導(dǎo)致聚磷菌吸收VFA的量減少。

2．4．2 亞硝酸鹽對PAOs釋放磷酸鹽的影響

poly－P存在于所有的細(xì)胞中，可見其對細(xì)胞功能有著重要的作用。在EBPR系統(tǒng)中，poly－P的作用還不十分清楚，但是目前被廣泛認(rèn)同的一個重要作用是胞內(nèi)poly－P的水解能夠為VFA的吸收和PHA的合成提供能量［19］。

厭氧條件下P的釋放和VFA的吸收的比率P／VFA是考察PAOs性能的一個重要參數(shù)［14］，表示了PAOs每吸收一個單位的VFA所釋放的P的量，而吸收VFA所需的能量主要來自于poly－P的水解，所以說P／VFA的值體現(xiàn)的是吸收一個單位的VFA所需能量的多少。圖4表示的是富集聚磷菌系統(tǒng)靜態(tài)試驗中不同亞硝酸鹽濃度下P／VFA的變化情況。與未投加亞硝酸鹽的情況相比，有亞硝酸鹽存在的系統(tǒng)中P／VFA的值較大，說明當(dāng)有亞硝酸鹽存在時需要更多的能量用于VFA的吸收。

4 富集聚磷菌系統(tǒng)靜態(tài)試驗中P／VFA的變化

在厭氧條件下，有亞硝酸鹽的除磷系統(tǒng)中P／VFA的比值較大，說明系統(tǒng)中可能發(fā)生了二次釋磷現(xiàn)象。所謂二次釋磷是指在厭氧條件下，不伴隨有機物（如乙酸等）的吸收以及多聚物（如PHB等）的合成的磷釋放。而引起二次釋磷的原因主要有2個：一是厭氧條件下加入降低PMF的物質(zhì)；二是細(xì)菌的內(nèi)源呼吸引起了胞內(nèi)多聚磷酸鹽的水解［21］。

Bond等［20］研究表明在堿性條件下，聚磷菌能夠通過降解體內(nèi)儲存的poly－P調(diào)節(jié)EBPR系統(tǒng)中的p H。Smolders等［14］研究認(rèn)為隨著p H值的升高，P／VFA的比值增大，即p H值的升高使得聚磷菌的釋磷能力得到了增強。厭氧條件下，聚磷菌吸收VFA的過程需要消耗PMF，而p H的升高會降低PMF，為了維持PMF值的恒定，聚磷菌需要水解更多的poly－P，所以升高的p H使得聚磷菌釋放磷酸鹽的量增多。由此可推測出，在富集聚磷菌的反應(yīng)瓶中，厭氧條件下亞硝酸鹽的投加促進了磷酸鹽的釋放，是因為亞硝酸鹽的存在破壞了聚磷菌細(xì)胞的PMF，為了維持PMF恒定，為聚磷菌吸收VFA提供能量，聚磷菌需要分解更多的poly－P，為厭氧代謝過程提供能量。

3 結(jié) 論

1）人工配水富集聚磷菌的活性污泥中，當(dāng)亞硝態(tài)氮的濃度超過10 mg／L時，聚磷菌吸收VFA的過程受到抑制，使得PHA的合成量減少，釋磷量增加；在SBR短程脫氮除磷活性污泥中，當(dāng)亞硝態(tài)氮濃度達到30 mg／L時，聚磷菌的厭氧代謝沒有受到抑制。

2）人工配水富集聚磷菌的活性污泥，有亞硝酸鹽與未投加亞硝酸鹽的情況相比，P／VFA明顯增大，即有亞硝酸鹽存在時需要更多的能量用于VFA的吸收。

3）SBR短程脫氮除磷活性污泥加入亞硝酸鹽后發(fā)生異養(yǎng)菌的反硝化作用，引起異養(yǎng)反硝化菌與聚磷菌競爭VFA，在碳源不充足的情況下，造成聚磷菌合成PHA和釋磷量的減少。

4）厭氧條件下，來自不同工藝的污泥對于亞硝酸鹽的耐受能力不同，與活性污泥的微生物組成有關(guān)。采用FISH技術(shù)對2種活性污泥中的聚磷菌做定量分析，發(fā)現(xiàn)人工配水富集聚磷菌活性污泥中聚磷菌含量達到55%，而短程脫氮除磷活性污泥中的聚磷菌為7．6%。處理生活污水的活性污泥菌群比人工配水富集聚磷菌系統(tǒng)中的菌群更加復(fù)雜，其對亞硝酸鹽的耐受能力更強。

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