楊士杰 姜達

他汀類藥物是臨床上治療高膽固醇血癥的主要藥物。研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有抗腫瘤作用。實驗室研究顯示他汀類藥物可抑制多種腫瘤得增殖，如乳腺癌［1］、結(jié)腸癌［2］、胰腺癌［3］、白血?。?］、惡性膠質(zhì)瘤［5］等。有關(guān)他汀類藥物對肝癌作用的實驗室研究，筆者尚未見國內(nèi)報道。本實驗就他汀類藥物對肝癌細胞增殖作用影響做一初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 辛伐他汀為中國藥品生物制品鑒定所產(chǎn)品，購自河北省藥檢所，用乙醇溶解NaOH激活［6］，HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4備用。人肝癌細胞株SMMC-7721購自中國科學(xué)院上海細胞存儲中心，p21Ras、NF-κB抗體為美國 Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品。

1.2 MTT實驗檢測SMMC-7721的增殖 取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后，用含辛伐他汀 0、5、10、20 μmol/L培養(yǎng)基作用 24、48、72 h。加入 MTT 繼續(xù)培養(yǎng) 4～6 h，吸出培養(yǎng)液加入DMSO。于搏賽酶標儀波長570 nm處測定OD值，計算細胞的存活率。每個濃度設(shè)3個平行孔。

1.3 流式細胞術(shù)測定p21Ras、NF-κB 取對數(shù)生長期的細胞，接種于培養(yǎng)瓶，待細胞貼壁后，用含辛伐他汀 0、5、10、20 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。常規(guī)洗滌、消化、乙醇固定。取單細胞懸液加入鼠抗人單克隆抗體p21Ras、NF-κB，流式細胞儀檢測。并下述公式計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對SMMC-7721細胞增殖的影響 MTT比色法分析顯示辛伐他汀作用后細胞增殖被抑制，呈現(xiàn)劑量-時間依賴效應(yīng)。因用乙醇溶解藥物，乙醇對照對增殖無影響。見圖1。

圖1 辛伐他汀對肝癌細胞SMMC-7721抑瘤率

2.2 辛伐他汀對SMMC-7721肝癌細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達的影響 辛伐他汀作用SMMC-772148 h后，NF-κB的FI值分別為(1.00 ±0.02)、(0.95 ±0.01)、(0.86 ±0.02)、(0.74 ±0.02)。表明隨著濃度增高，NF-κB表達呈進行性下降(P=0.0001)。見圖 2。

圖2 辛伐他汀對SMMC-7721細胞NF-κB表達的影響

2.3 辛伐他汀對SMMC-7721肝癌細胞核轉(zhuǎn)錄因子cdk2表達的影響 辛伐他汀作用SMMC-772148 小時后，cdk2的FI值分別為(1.00 ±0.01)、(0.94 ± 0.02)、(0.91 ± 0.02)、(0.81 ±0.01)。表明隨著辛伐他汀濃度增高，cdk2表達呈進行性下降(P=0.001)。見圖3。

圖3 辛伐他汀對SMMC-7721細胞cdk2表達的影響

3 討論

汀類藥物是臨床上治療高膽固醇血癥的代表性藥物，這類藥物是膽固醇合成限速酶——羥甲基戊二酸單酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑。他汀類藥物結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈部分與HMG-CoA結(jié)構(gòu)十分相似，和HMG-CoA還原酶的親和力較HMG-CoA強10000 倍。他汀類藥物能顯著降低HMG-CoA還原酶活性，抑制其下游產(chǎn)物的合成，后者包括膽固醇、長醇、泛醌、異戊烯腺嘌呤、焦磷酸法呢酯(FPP)等小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等多種效應(yīng)中起到重要作用。

常見的他汀類藥物有美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀等。在眾多的他汀類藥物中，大部分藥物是其活性形式，在體外具有抗腫瘤活性。只有洛伐他汀和辛伐他汀是無活性的藥物前體，需在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為β-羥基酸形式，才具有活性。在本實驗中，我們曾用乙醇溶解的辛伐他汀直接作用于細胞，未觀察到細胞增殖受抑。按文獻［6］用NaOH激活以后，可以觀察到辛伐他汀的抗增殖作用、促凋亡作用以及降低侵襲力作用，并可見到NF-κB、cdk2表達量的改變。

NF-κB廣泛存在于細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子之一，不僅與機體的免疫應(yīng)答、細胞增殖、生長分化、細胞周期以及凋亡有關(guān)，而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，其過表達能誘導(dǎo)細胞的惡變［7］。NF-κB尚可作用于細胞周期蛋白 cyclinD1，啟動cyclinD1的轉(zhuǎn)錄，促使G1、G0期向S期轉(zhuǎn)化，使癌細胞無限增殖［8］。本研究顯示辛伐他汀處理SMMC-7721細胞48 h后，能下調(diào)細胞中NF-κB的表達水平，且細胞的增值也受到影響?？赡苁切练ニ∫种屏薔F-κB的表達水平，抑制了腫瘤細胞的無限增值。

細胞增殖通過細胞周期實現(xiàn)的，細胞周期受細胞周期蛋白依賴激酶(cdk)的嚴格調(diào)控。他汀類藥物能影響細胞周期進程，阻滯髓樣白血病細胞、乳腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、前列腺癌細胞等多種腫瘤細胞于G1期，同時伴有細胞周期蛋白依賴性激酶cdk2、cdk4、cdk6。本實驗中，應(yīng)用辛伐他汀處理肝癌細胞SMMC-772148 hr，可引起cdk2以一種劑量依賴性方式下調(diào)。cdk2除在細胞周期中具有重要意義外，還具有Rb蛋白激酶的活性。目前的研究認為，視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)是細胞G1期進入S期的“開關(guān)”，Rb有兩種形式，即磷酸化的失活形式和失磷酸化的活性形式。活化的cdk2可使Rb磷酸化而失活。失活的Rb同核轉(zhuǎn)錄因子E2F家族成員解離，促進S期DNA的合成，加快腫瘤細胞的生長?；罨腞b和核轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，進而影響下游轉(zhuǎn)錄因子和端粒酶的活性，抑制DNA的合成從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

1 周永，糜漫天，張干勇，等.膽固醇抑制劑洛伐他汀對MCF 7細胞增殖分化功能及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響.腫瘤防治研究，2003，30:210-213.

2 Banke A，Sanjay B，Balasz H，et al.Lovastatin augments apoptosis induced by chemotherapeutic agents in colon cancer cells.Clinical Cancer Research，1999，5:2223-2229.

3 Toshiyuki K，Mutsuko M，Teruo I，et al.Inhibition of Epidermal Growth Factor-induced RhoA Translocation and Invasion of Human Pancreatic Cancer Cells by 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A Reductase Inhibitors.Cancer Rrsearch，2001，61:4885-4891.

4 國風(fēng)，岑建農(nóng)，陳子興，等.膽固醇合成抑制劑洛伐他汀對NB4細胞體外作用的研究.中華血液雜志，2002，22:584-587.

5 Jonc CD，Couldwell WT，Hinton DR，et al.Lovastatin induces growth inhibition and apoptosis in human malignant glioma cells.Biochem Biophys Res Commun，1994，205:1681-1687.

6 Marco R，Lorenzo A，Paul M，et al.Pharmacological control of the mevalonate pathway:effect on arterial smooth muscle Cell Proliferation.JPET，1997，281:1144-1153.

7 Shibata A，Naggaya T，Imai T，et al.Inhibition of NF-kappaB activity decreas the VEGF mRNA expression in MDA-MB-231 breast cancer cell.Breast Cancer Res Treat，2002，73:237-243.

8 Hinz M，Krappmann D，Eichten A，et al.NF-κB function in growth contral:regulation of cyclin D1 expression andG0/G1-to–S-phase transition.Mol Cell Biol，1999，19:2690-2698.