陶崢 柴永川 李磊 李曉華 楊濤 吳皓

·臨床研究·

一個Pendred綜合征家系的臨床及SLC26A4基因檢測分析△

陶崢1柴永川2，3＃李磊2，3李曉華2，3楊濤2，3吳皓2，3

目的 探討Pendred綜合征的臨床表現(xiàn)及SLC26A4基因檢測特點(diǎn)。方法 對一個多人患病的Pendred綜合征家系進(jìn)行詳盡的臨床表型分析，并對其中4例耳聾患者進(jìn)行SLC26A4基因全編碼序列及側(cè)翼序列的檢測。結(jié)果 該家系共三代15人，其中6人（40.0%）為耳聾患者，6例均為語前感音神經(jīng)性聾，2例（Ⅰ－3和Ⅱ－7）表現(xiàn)為言語障礙，5例（Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅱ－7、Ⅲ－1、Ⅲ－2）伴單純甲狀腺腫大、3例（Ⅱ－5、Ⅲ－1、Ⅲ－2）伴前庭水管擴(kuò)大。Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅲ－1和Ⅲ－2這4例耳聾患者中共發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因四種不同的突變，患病成員中先證者（Ⅲ－1）及其父親（Ⅱ－4）、母親（Ⅱ－5）和妹妹（Ⅲ－2）分別具有p.Q514P和p.H723R、p.N392Y和p.H723R、c.1548insC和p.Q514P、p.N392Y和c.1548ins C雙等位基因突變。結(jié)論 該家系先證者及其父母、妹妹分別由SLC26A4基因不同復(fù)合雜合突變導(dǎo)致Pendred綜合征；在發(fā)現(xiàn)的四種突變中，p.Q514P是既往研究未報道的新發(fā)突變。

Pendred綜合征； SLC26A4基因； 聽力損失； 基因突變

Pendred綜合征（Pendred syndrome，PS）又稱耳聾－甲狀腺腫綜合征，臨床主要以前庭水管擴(kuò)大、感音神經(jīng)性聾和碘有機(jī)化功能障礙為特征，后者可表現(xiàn)為甲狀腺腫大和／或高氯酸鹽釋放試驗(yàn)陽性。PS在遺傳學(xué)上表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳模式，致病基因最先由Everett等［1］在一個PS家系中定位克隆，并被命名為PDS基因。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該基因突變也可引起非綜合征型大前庭水管（non－syndromic enlargement of vestibular aqueduct，nsEVA）耳聾［2］。由于PDS基因與溶質(zhì)蛋白家族SLC26其他成員的結(jié)構(gòu)和功能類似，故PDS基因又重新命名為SLC26A4基因（solute carrier family 26，member 4，SLC26A4）。

目前認(rèn)為，nsEVA和PS是與SLC26A4有關(guān)的同一種遺傳病的兩種不同的表現(xiàn)［3］。近年來，SLC26A4基因在nsEVA和PS疾病中的篩查研究已得到了較為廣泛的開展。本研究對一個多人患病的中國PS家系進(jìn)行了詳細(xì)的分子遺傳學(xué)分析，找到了該家系發(fā)病的分子病因，并確定了一個從未報道過的新發(fā)突變，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 一個來自上海市的PS家系，總共三代15人，其中有6例耳聾患者，詳細(xì)家系圖如圖1，其中患者Ⅰ－3和Ⅱ－7未收集到詳細(xì)臨床資料及用于分子遺傳學(xué)檢測的血樣，其余4例耳聾患者Ⅱ－4（男，先證者的父親）、Ⅱ－5（女，先證者的母親）、Ⅲ－1（先證者）及Ⅲ－2（女，先證者的妹妹）臨床資料和血樣完整。先證者為（Ⅲ－1）女性，28歲，自出生后即對聲音反應(yīng)差，現(xiàn)表現(xiàn)為言語障礙，純音測聽示極重度感音神經(jīng)性聾；患者自11歲起逐漸出現(xiàn)頸部腫大，檢查甲狀腺功能正常，診斷為單純性甲狀腺腫大，除了給予高碘飲食治療外未進(jìn)行其他治療。體檢發(fā)現(xiàn)甲狀腺Ⅱ度腫大，邊界清楚，質(zhì)地柔軟，無震顫及血管雜音，前庭功能檢查未見異常。家系中另5例患者均表現(xiàn)為先天性感音神經(jīng)性聾，除患者Ⅰ－3外，其它所有患者均于青春期左右開始伴不同程度的甲狀腺腫大。

1.2 臨床檢查方法 頸部B超；甲狀腺功能檢測，包括血清游離T3、T4（FT3、FT4）、促甲狀腺素（TSH）；純音測聽并對耳聾程度分級診斷，依據(jù)歐洲工作組倡導(dǎo)的遺傳性聾的分級標(biāo)準(zhǔn)［4］：輕度聽力損失（20～40 dB HL）、中度聽力損失（41～70 dB HL）、重度聽力損失（71～95 d B HL）及極重度聽力損失（＞95 dB HL）；高分辨率顳骨CT掃描診斷前庭水管擴(kuò)大的標(biāo)準(zhǔn)為：前庭水管外口至半規(guī)管總腳中點(diǎn)直徑≥1.5 mm。

圖1 Pendred綜合征家系遺傳圖譜

1.3 SLC26A4基因突變檢測 在簽署知情同意書后，抽?、颍?、Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2患者外周靜脈血2 ml，3.2%檸檬酸鈉抗凝，無菌4℃保存待檢。所有程序均通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3.1 DNA提取 使用吸附柱吸附DNA分離方法（TIANamp Blood DNA kit）在全血中提取基因組DNA，利用核酸檢測儀（NANODROP 2000）進(jìn)行定量和純度分析。取一定量的DNA原液稀釋成10 ng／μl的工作濃度，－20℃保存?zhèn)溆茫珼NA原液－80℃保存。

1.3.2 巢式PCR擴(kuò)增及測序 在每一個需要擴(kuò)增的目的基因片段外圍設(shè)計兩對引物，遠(yuǎn)離目的基因片段的一對引物為外側(cè)引物，即第一輪PCR的引物，靠近目的基因片段的一對引物為內(nèi)側(cè)引物，即第二輪PCR的引物。PCR擴(kuò)增SLC26A4基因編碼區(qū)及側(cè)翼序列，引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考柴永川等［5］的方法。兩輪PCR反應(yīng)結(jié)束后將第二輪PCR產(chǎn)物直接測序，測序結(jié)果應(yīng)用Sequencher 4.9軟件進(jìn)行分析。對于遺傳學(xué)上檢測到的新發(fā)突變，則選取200例聽力正常的對照人群進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的檢測，以排除遺傳學(xué)上常見的無功能的多肽。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查結(jié)果 經(jīng)詳細(xì)的病史詢問及體格檢查，家系中有6例（40.0%，6／15）耳聾患者，其中患者Ⅰ－3和Ⅱ－7表現(xiàn)為言語障礙，只能靠手語或書面交流，患者Ⅰ－3甲狀腺無腫大，患者Ⅱ－7甲狀腺Ⅱ度腫大，前庭功能檢查未見異常，患者Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2顯示甲狀腺功能正常，B超均顯示為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大；純音測聽（PTA）6例患者均為雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，高頻聽力損失更嚴(yán)重；Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2的顳骨巖部高分辨率CT提示為前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大（EVA）（表1）。

表1 家系中4例耳聾患者臨床檢查結(jié)果

表2 家系中4例耳聾患者SLC26A4基因檢測情況

2.1 SLC264基因檢查結(jié)果（表2） 家系中Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅲ－1及Ⅲ－2這4例耳聾患者進(jìn)行了SLC26A4基因編碼區(qū)及側(cè)翼序列檢測，患者Ⅱ－4攜帶p.N392Y／p.H723R復(fù)合雜合突變、Ⅱ－5攜帶c.1548ins C／p.Q514P復(fù)合雜合突變、Ⅲ－1攜帶p.Q514P／p.H723R復(fù)合雜合突變、Ⅲ－2攜帶有p.N392Y／c.1548insC復(fù)合雜合突變，四種突變的測序峰圖見圖2。在200例聽力正常的對照人群中未檢測出p.Q514P突變。同時，通過Clustal W2在線軟件比較不同物種SLC26 A4基因編碼的蛋白質(zhì)的差異以進(jìn)行保守性分析，結(jié)果顯示Pendrin蛋白514位上的谷氨酰胺高度保守（圖3）。

圖2 研究家系中SLC26A4基因四種不同突變的測序峰圖

3 討論

PS是引起綜合征型聾的主要疾病之一，其發(fā)病率估計為7.5／10萬～10／10萬，大約占遺傳性聾的10%。PS的診斷主要依據(jù)為：①雙側(cè)感音神經(jīng)性聾（診斷PS的必備條件）：大多數(shù)患者表現(xiàn)為重度－極重度的語前聾，部分患者表現(xiàn)為語后聾，聽力可呈波動性、突發(fā)性或進(jìn)行性下降［6，7］；②內(nèi)耳形態(tài)學(xué)異常：所有PS患者都有內(nèi)淋巴系統(tǒng)擴(kuò)大，最常見的是前庭水管擴(kuò)大，其次為Mondini畸形［6，8］，但它們并不是PS患者的特異性表現(xiàn)，因?yàn)槠渌恍┥僖姷募膊∪邕h(yuǎn)端腎小管酸中毒、瓦登伯格綜合征、腮－耳－腎綜合征等在少數(shù)情況下也可有前庭水管擴(kuò)大，同時這些疾病也有各自的特殊臨床表現(xiàn)，應(yīng)注意鑒別［9］；③甲狀腺碘離子有機(jī)化功能障礙：可表現(xiàn)為單純性甲狀腺腫和／或高氯酸鹽釋放試驗(yàn)陽性，與聽力障礙程度無關(guān)；甲狀腺腫大呈進(jìn)行性，兒童常為彌漫性腫大，在成人大多數(shù)有明顯的結(jié)節(jié)，但無血管雜音及震顫感［10］。通常高氯酸鹽釋放試驗(yàn)對甲狀腺碘離子有機(jī)化功能障礙的判斷具有更好的敏感性，PS患者該實(shí)驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，即第一次行甲狀腺攝131I率檢測后，給予10 mg／kg過氯酸鉀口服，1小時后再行甲狀腺攝131I率檢測，正常人無明顯下降，而該病患者下降大于10%。但值得注意的是體內(nèi)甲狀腺素的產(chǎn)生是一個多環(huán)節(jié)的生物合成過程，其他一些影響其合成的因素，如甲狀腺素合成酶的先天性缺陷、橋本甲狀腺炎、抗甲狀腺藥物的應(yīng)用及甲狀腺內(nèi)無機(jī)碘過多等，高氯酸鹽釋放試驗(yàn)也會呈陽性反應(yīng)，因此，高氯酸鹽釋放試驗(yàn)陽性并不是PS的唯一診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床上診斷PS需要上述三方面綜合考慮?？紤]高氯酸鹽釋放試驗(yàn)具有一定的副作用，本研究家系沒有進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)的檢測，但家系中有詳細(xì)資料的4例患者都具有雙側(cè)感音神經(jīng)性聾、雙側(cè)前庭水管擴(kuò)大（Ⅱ－4未做）、單純性甲狀腺腫大，符合PS診斷依據(jù)。值得注意的是，對于臨床上僅表現(xiàn)為雙側(cè)感音神經(jīng)性聾和內(nèi)耳形態(tài)學(xué)異常（EVA和／或Mondini畸形）而沒有甲狀腺腫大的患者，應(yīng)注意甲狀腺腫大發(fā)生的時間可能在青春期以后或者不發(fā)生，此時高氯酸鹽釋放試驗(yàn)是區(qū)別nsEVA和PS的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 p.Q514P在不同物種中的保守性分析 利用ClustlW2軟件在線分析人類Pendrin蛋白514位氨基酸在不同物種中的保守性，結(jié)果顯示514位氨基酸在不同物種中高度保守

研究表明，SLC26A4是nsEVA／PS最主要的致病基因，有21個外顯子，編碼含有780個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)pendrin。到目前為止，引起nsEVA和PS疾病的SLC26A4基因突變超過170種（http：／／ww w.healthcare.uiowa.edu／labs／Pendredandbor／slc Mutations.htm）。本研究通過對該P(yáng)S家系中4例耳聾患者進(jìn)行SLC26A4基因檢測，發(fā)現(xiàn)p.N392Y、c.1548insC、p.H723R、p.Q514P四種突變，所有受檢者都有SLC26A4雙等位基因的突變，符合PS隱性遺傳規(guī)律。這四種突變中，三種突變（p.N392 Y、c.1548insC和p.H723R）在既往文獻(xiàn)中已報道，其致病性明確，且p.H723R是中國人群中僅次于c.919－2 A＞G的熱點(diǎn)突變，占總突變數(shù)的9.04%，而p.N392Y也是較為常見的突變之一，占2.82%［11］。c.1548insC屬于移碼突變，此突變將引起含有780個氨基酸殘基的Pendrin截斷255氨基酸，即突變型Pendrin僅有525個氨基酸殘基，同時Fuqazzola等［12］曾對Pendrin蛋白截斷到548個氨基酸殘基的移碼突變p.S523fsX548進(jìn)行功能學(xué)研究，證實(shí)突變型蛋白在細(xì)胞膜失去了正常的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，致病性明確，而相對于p.S523fsX548，c.1548insC引起的突變型蛋白截斷的更多，其致病性毋庸置疑。c.1541A＞C（p.Q514P）是一個新發(fā)現(xiàn)的突變，位于SLC26A4基因的13外顯子上，此改變導(dǎo)致了第514位的親水性氨基酸谷氨酰胺被疏水性氨基酸脯氨酸所取代。推測p.Q514P是一個致病性錯義突變，理由如下：①此突變在200例對照人群中未檢出；②突變氨基酸具有高度保守性：Pendrin蛋白514位上的谷氨酰胺具有高度保守性（圖3），這種進(jìn)化上的高度保守性說明谷氨酰胺對Pendrin蛋白的功能至關(guān)重要；③突變p.Q514P導(dǎo)致脯氨酸替代了514位的谷氨酰胺，而Pera等［13］通過功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)在蛋白質(zhì)水平上脯氨酸的增減對Pendrin蛋白的功能是有害的，一般是致病突變；④具有p.Q514P突變的患者在另外一等位基因上具有一個已明確的致病突變，并且除此之外未發(fā)現(xiàn)任何可疑的致病突變，這與PS疾病的隱性遺傳模式一致。值得注意的是，以上四點(diǎn)只是對p.Q514P具有突變致病性的有力的間接證據(jù)，而p.Q514P是否真正致病及突變型Pendrin如何致病需要進(jìn)一步的功能試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

PS患者在聽力學(xué)上主要表現(xiàn)為雙側(cè)感音神經(jīng)性聾，以高頻聽力損失為主，聽力圖多為下降型，少部分為平坦型。然而，聽力損失發(fā)生的時間和程度可呈現(xiàn)多樣性，多數(shù)患者表現(xiàn)為先天性的重—極重度感音神經(jīng)性聾，若沒有及時干預(yù)則出現(xiàn)明顯的言語障礙，文中報道的家系中6例聽力損失者的聽力狀況與此一致；另外，部分患者的聽力損失可表現(xiàn)為緩慢進(jìn)行性下降，這類患者常出現(xiàn)在兒童后期，一般存在前庭水管擴(kuò)大，頭部外傷多為聽力進(jìn)一步惡化的誘因［14］；少數(shù)PS患者可有耳鳴，甚至出現(xiàn)眩暈［15］。目前對于PS患者的感音神經(jīng)性聾無有效治療方法，聽力損失較輕時可以佩戴助聽器以改善聽力，當(dāng)佩戴助聽器無效時，人工耳蝸植入可作為一種重要的治療手段，并且大多數(shù)患者能取得較為滿意的效果［16］；對于甲狀腺腫，一般使用甲狀腺素替代治療，大多不宜手術(shù)治療，因致病因素持續(xù)存在，術(shù)后易復(fù)發(fā)，且甲狀腺功能在術(shù)前多屬正常，術(shù)后易出現(xiàn)甲狀腺功能低下、甲狀旁腺功能低下及喉返神經(jīng)損傷等并發(fā)癥。

因PS缺乏特效及經(jīng)濟(jì)的治療方法，給患者本人和社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，作為一種常見的隱性遺傳性疾病，可通過致病基因檢測、遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷預(yù)防該病患兒的出生。本家系遺傳圖譜顯示，患者Ⅱ－4和Ⅱ－5屬于同征婚配，其后代將100%罹患本病，若婚前明確遺傳學(xué)病因并避免同征婚配，則完全可以預(yù)防患者Ⅲ－1和Ⅲ－2的出生，即使父母為SLC26 A4基因突變的攜帶者，也可以通過產(chǎn)前基因診斷有效地避免聾兒的出生。因此，對本病的臨床認(rèn)識以及基于臨床診斷的分子遺傳學(xué)研究將成為本病早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)及有效預(yù)防的關(guān)鍵。

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（2012－06－18收稿）

（本文編輯 李翠娥）

CIinicaI and MoIecuIar Diagnosis in a Big Chinese FamiIy with Pendred Syndrome

Tao Zheng*，Chai Yongchuan，Li Lei，Li Xiaohua，Yang Tao，Wu Hao
（*Department of OtoIaryngoIogy，ChiIdren MedicaI Center AffiIiated to Shanghai Jiaotong University SchooI of Medicine，Shanghai，200127，China）

Objective To elucidate the clinical diagnosis and molecular pathogenesis of Pendred syndrome in a big Chinese family.Methods Clinical materials and DNA sample were obtained from the Pendred syndrome family.The exons and the flanking splicing sites of SLC26A4 were screened in the 4 major patients in this family by nested PCR and direct sequencing.ResuIts The clinical characterizations of patients in this family included the prelingual sensorineural hearing loss，dysphonia，goiter，normal thyroid function and enlarged vestibular aqueduct.A total of 4 different types of SLC26 A4 mutations were identified in the family.The proband，his father，his mother and his sister were carried with different SLC26 A4 biallelic mutations which were p.Q514P and p.H723R，p.N392Y and p.H723R，c.1548insC and p.Q514P，p.N392Y and c.1548insC，respectively.ConcIusion The proband，his father，his mother and his sister with Pendred syndrome were caused by different biallelic mutations of SLC26A4.In the 4 types of SLC26A4 mutations，p.Q514P is novel，which has not been yet reported in the previous literatures.

Pendred syndrome； SLC26 A4 gene； Hearing loss；Mutation

10.3969／j.issn.1006－7299.2012.06.006

時間：2012－11－01 12：48

R764.44

A

1006－7299（2012）06－0528－05

△ 國家自然科學(xué)基金（30971596；81170924）、衛(wèi)生部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201202005）、上海市教育委員會和上海市教育發(fā)展基金會“曙光計劃”（09SG19）、上海市浦江人才計劃（11PJ1407000）、上海高校特聘教授（東方學(xué)者）崗位計劃資助

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉科（上海 200127）； 2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科；3 上海交通大學(xué)耳科學(xué)研究所

陶崢，女，上海人，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閮和犃φ系K的診治、干預(yù)。柴永川，男，江西人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)槊@病的遺傳及分子生物學(xué)研究。

吳皓（Email：wuhao622＠sh163.net）；楊濤（Email：yangtfxl＠sina.com）

＃ 為并列第一作者

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