高寧，王強，王振月，程玉鵬，3＊

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300192；3.哈爾濱師范大學，哈爾濱 150024）

柴胡為傘形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC.）或 狹 葉 柴 胡 （BupleurumscorzonerifoliumWilld.）的干燥根，是我國傳統(tǒng)的重要中藥材［1］。柴胡中含有皂苷、甾醇、黃酮、揮發(fā)油、多糖等成分，主要藥效成分為柴胡皂苷，其中柴胡皂苷a，d具有明顯的藥理活性。柴胡的藥理作用廣泛，具有鎮(zhèn)靜、解熱、抗炎、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活性等作用，極具開發(fā)與研究前景［2－3］。但近幾年，由于對柴胡野生藥用資源的盲目、過度采挖，致使柴胡的藥用資源日益減少，已不能滿足市場的需要。內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是一類普遍存在于健康植物體內(nèi)的，不引起宿主病變的共生菌。研究表明，某些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學成分，特別是近年來，相繼發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)紫杉醇、長春花堿等有效成分的內(nèi)生真菌，使得藥用植物內(nèi)生真菌這一研究領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注［4］。由于柴胡資源日益緊張，因此，對柴胡開展內(nèi)生真菌研究，明確柴胡內(nèi)生真菌分布特征，將有助于進一步開發(fā)能夠產(chǎn)生有效成分的柴胡內(nèi)生真菌、篩選并減少對野生柴胡的依賴，降低經(jīng)濟與生態(tài)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

原植物采自黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為狹葉柴胡（BupleurumscorzonerifoliumWilld.）。

試劑：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000m L，瓊脂15g。121℃高壓蒸汽滅菌30min），乳酸－棉蘭染液，升汞，醫(yī)用酒精等。

儀器：電熱手提式壓力蒸汽消毒器（哈爾濱市松花江醫(yī)療器械廠）、Ⅱ級B2型生物安全柜（北京哈爾東聯(lián)儀器制造有限公司）、PH－71電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、奧林巴斯CX31顯微鏡（奧林巴斯（中國）有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 柴胡內(nèi)生真菌的分離

取新鮮健康的狹葉柴胡植株，用洗潔劑清洗材料表面，蒸餾水沖洗干凈，除去泥土大顆粒及表面浮灰。表面消毒：無菌條件下將實驗材料放入75%乙醇中浸泡45s，無菌水沖洗4～5次（每次2min），隨后放入0.1%升汞溶液中浸泡3min，無菌水沖洗4～5次（每次2min）。用無菌刀片將根切成5mm×5mm×5mm的小塊，將莖切成5mm的小段，將葉切成5mm×5mm的小片。將切好的材料放入PDA培養(yǎng)基中，每個平皿中放置4～5塊，并盡量將切面貼于培養(yǎng)基。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置，暗培養(yǎng)5～10天，每日定時觀察材料，待材料切口處長出菌絲后，及時地挑取前端的菌絲，將其轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用菌絲頂端純化法逐步純化柴胡內(nèi)生真菌。將純化的菌種編號，轉(zhuǎn)入PDA斜面，置于4℃冰箱中保存［5］。

1.2.2 狹葉柴胡內(nèi)生真菌的鑒定

采用點植法觀察柴胡內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)，利用插片法觀察柴胡內(nèi)生真菌顯微結(jié)構(gòu)特征，參照文獻［6－7］進行柴胡內(nèi)生真菌的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 狹葉柴胡內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

從狹葉柴胡中共分離得到13株內(nèi)生真菌，其中根中分離得到7株，葉中分離的到2株，莖中分離得到4株。經(jīng)形態(tài)學觀察與顯微鑒定，除一株毛霉屬真菌為接合菌亞門外，其余分屬于半知菌類的2目、3科、6屬。狹葉柴胡內(nèi)生真菌各屬具體分布見表1。

表1 狹葉柴胡內(nèi)生真菌的分布特征

2.2 柴胡內(nèi)生真菌分布特征

已鑒定的13株柴胡內(nèi)生真菌分屬于7個不同的屬，于柴胡的根、莖、葉中都可分離到內(nèi)生真菌，表明狹葉柴胡內(nèi)生真菌具有一定的多樣性且內(nèi)生真菌在狹葉柴胡各組織均有分布。但各組織中所分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量差距較大，其中根中分離得到7株，明顯高于莖（4株）與葉（2株）中分離的內(nèi)生真菌數(shù)量。所分離出的內(nèi)生真菌以半知菌為主，分離出的內(nèi)生真菌中，并沒有優(yōu)勢單一的菌群，且未見某一種屬在根、莖、葉均能夠有分布。特別是曲霉屬、毛霉屬僅在根中分離得到，而鐮刀孢屬真菌僅在莖中分離得到，表明狹葉柴胡內(nèi)生真菌的分布具有一定的組織專一性。

3 結(jié)論與討論

以往研究結(jié)果顯示，不同植物中分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量與種類均存在差異［8］，本研究共從狹葉柴胡中分離得到13株內(nèi)生真菌，分屬于7個不同屬，且各屬真菌分布并不均一，表明狹葉柴胡內(nèi)生真菌具有一定的生物多樣性，且分布具有一定的組織專一性。

研究過程中發(fā)現(xiàn)，狹葉柴胡組織塊表面消毒的方法直接影響內(nèi)生真菌的分離效果，研究之初，本項目組采用已有的表面消毒方法，然而效果并不理想，由于各植物表面結(jié)構(gòu)及組織本身特點存在差異，使得表面消毒劑的種類及消毒時間需酌情而定，一些方法雖然能夠適用于幾種植物與組織，但尚未有一種能夠普遍適用的表面消毒程序，因此，在開始分離某一植物內(nèi)生真菌時，要對所用消毒劑的種類、聯(lián)合使用的組合方式及消毒時間等進行系統(tǒng)的考察，使其能夠在不傷及內(nèi)生真菌的前提下殺滅植物表面真菌。

內(nèi)生真菌分離過程中另一個重要問題是內(nèi)生細菌的影響。植物內(nèi)生菌大體可分為內(nèi)生真菌與內(nèi)生細菌，與內(nèi)生真菌相似，內(nèi)生細菌同樣廣泛的存在于各種屬植物中，且其生長迅速，一般1～2天即可從組織切面處長出，影響了后續(xù)內(nèi)生真菌的分離與純化。因此，本實驗在真菌純化過程中向培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素從而抑制內(nèi)生細菌的生長，排除干擾。另外，在內(nèi)生真菌分離過程中，要注意每日觀察，及時挑取從切面處長出的內(nèi)生真菌，同時要挑取菌絲生長的最前端部分，特別是同一切面同時長出2種以上內(nèi)生真菌時，要注意防止交叉污染。

由于內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的有效成分，且真菌具有易培養(yǎng)、易控制、生產(chǎn)成本低、生長快等特點，使得這一研究領(lǐng)域受到科學工作者的廣泛關(guān)注，本研究對柴胡內(nèi)生真菌進行了分離并探討了柴胡內(nèi)生真菌的分布特征，有關(guān)能夠產(chǎn)生有效成分的狹葉柴胡內(nèi)生真菌的篩選與開發(fā)利用將在進一步的研究工作中開展。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.2010版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

［2］吳明芳.中藥柴胡中的有效成分及其藥理作用的研究進展［J］.中華中西醫(yī)學雜志，2010，8（6）：32－34.

［3］張陽，李敏，柳林，等.柴胡生長發(fā)育規(guī)律的分析［J］.中國林副特產(chǎn)，2010（5）：45－46.

［4］胡鳳，程玉鵬，王振月，等.藥用植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用前景［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19（5）：781－783.

［5］程玉鵬，王振月，李慧玲，等.盤龍參內(nèi)生真菌分布特征的研究［J］.中國林副特產(chǎn)，2008（2）：22－23.

［6］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學技術(shù)出版社，1979.

［7］H.L.巴尼特，B.B.亨特.沈崇堯，譯.半知菌屬圖解［M］.北京：科學出版社，1977.

［8］姜怡，楊穎，陳華紅，等.植物內(nèi)生菌資源［J］.微生物學通報，2005，32（6）：146－147.